光能變價(jià)離子鈦對(duì)煙草青枯雷爾氏菌和野火病菌的抑制作用

余佳敏，劉 穎，肖建華，肖 勇，江 鴻，余祥文*

(1.中國(guó)煙草總公司四川省公司，四川 成都 610041； 2.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究室，重慶 400715；3.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040)

煙草青枯病和野火病是煙草生長(zhǎng)過(guò)程中重要的細(xì)菌性病害。其中，青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum，以下簡(jiǎn)稱(chēng)青枯菌)引起的一種土傳病害，煙株根、莖、葉均可受害，在我國(guó)南方煙區(qū)，尤其在廣東、福建、湖南、四川和貴州發(fā)病嚴(yán)重[1]，帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。而煙草野火病則由煙草假單胞桿菌屬，丁香假單胞煙草致病變種(Pseudomonassyringaepv.tabaci)引起，主要為害煙草葉部，在云南、貴州、四川等省份發(fā)生較為普遍[2]。目前對(duì)這2種病害的防治仍以化學(xué)防治為主，但化學(xué)防治導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、土壤生態(tài)環(huán)境的破壞等問(wèn)題越來(lái)越突出。因此，探索開(kāi)發(fā)抑制青枯病菌和野火病菌的高效、低毒新藥劑具有十分重要的意義。

近年來(lái)，鈦(Ti)在農(nóng)作物上的研究越來(lái)越廣泛，煙草上也做了大量研究。刑小軍等[3-5]曾報(bào)道鈦對(duì)烤煙和白肋煙煙株長(zhǎng)勢(shì)和煙葉品質(zhì)方面有顯著作用；焦湞等[6]曾報(bào)道低劑量鈦離子注入煙草種子可以引起種子發(fā)芽率及葉片含鉀量提高；張永輝等[7]曾報(bào)道鈦土肥對(duì)烤煙早花有一定的抑制作用。除了在生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)值產(chǎn)量等方面對(duì)作物存在影響外，在病害防治方面鈦也能起到一定作用。有研究指出，鈦對(duì)黃瓜霜霉病、白粉病、番茄和玫瑰的細(xì)菌性葉斑病的發(fā)生有一定的抑制作用[8-10]，對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑菌、茄假單孢菌、水稻白葉枯菌、婁徹氏霉菌、植物冠癭瘤致病菌根癌農(nóng)桿菌等有一定的抑菌效果[11-12]。此外，Goswani等[13]的研究也表明，鈦對(duì)稻米象有一定的防效。但目前其在煙草病蟲(chóng)害防治方面仍沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。

此外，據(jù)報(bào)道，與Ti相關(guān)的TiO2及光能變價(jià)離子鈦(TIVL)對(duì)多種細(xì)菌有良好的殺菌效果[12,14]。基于此，本實(shí)驗(yàn)選擇TIVL作為處理藥劑，以煙草青枯菌和野火病菌作為研究對(duì)象，探究鈦離子對(duì)煙草青枯菌以及野火病菌的抑制作用，為進(jìn)一步研究離子鈦抑制青枯菌和野火病的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為應(yīng)用離子鈦防治煙草青枯病和野火病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

光能變價(jià)離子鈦(TIVL)，簡(jiǎn)稱(chēng)離子鈦，由鈦谷(天津)科技有限公司惠贈(zèng)，未添加其他金屬元素，鈦離子母液濃度為4 mg·mL-1。

1.1.2 供試菌種

青枯菌菌株，由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究室提供，分離自煙草青枯病病株。

野火病菌菌株，由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究室提供，分離自煙草野火病病株。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 供試培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

NA培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母浸膏1.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水 1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值6.8～7.0，121 ℃滅菌20 min。

B培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酪朊水解物1.0 g，酵母提取物1.0 g，蒸餾水1 000 mL，在121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 供試菌劑的準(zhǔn)備

取保存的青枯菌和野火病菌菌株于NA平板上劃線，并置于(30±2)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落于液體B培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h，至D600為1.0(≈109mL-1)，離心收集菌體重懸于無(wú)菌水中，再以無(wú)菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋至約103mL-1備用。

1.2.3 平板抑菌試驗(yàn)

用150 mL三角瓶，配制固體NA培養(yǎng)基60 mL·瓶-1。高壓滅菌后，冷卻至約45 ℃左右，分別添加母液濃度為4 mg·mL-1的離子鈦0、120、240、360、480、540 μL，使其終濃度分別為0、8、16、24、32、36 mg·mL-1，未加離子鈦(0 mg·mL-1)的培養(yǎng)基為對(duì)照。搖勻后倒平板，每60 mL培養(yǎng)基倒3個(gè)平板，為3個(gè)重復(fù)。凝固后，吹干冷凝水，分別添加已備好的103mL-1青枯菌或野火病菌菌株，放入10～20顆滅菌玻璃珠進(jìn)行涂布。

將各處理放入(30±2)℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，分別于24、36、48、72和96 h拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 MIC和MBC測(cè)定

離子鈦對(duì)青枯菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)的測(cè)定是通過(guò)在固體培養(yǎng)基上菌株的存活力決定[15]。已熔化的NA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右加入離子鈦母液配置成終濃度為0、8、16、24、32、36 mg·L-1的帶藥培養(yǎng)基，充分混勻后，每皿20 mL，倒入培養(yǎng)皿中制成帶藥平板。在帶藥平板上均勻涂布100 μL菌懸液(約105mL-1)，隨后放入(30±2)℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)48和96 h后拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線

在50 mL的無(wú)菌的三角瓶中配制0(為空白對(duì)照)、16、24、32、36 mg·L-1的帶藥B培養(yǎng)基，然后在超凈工作臺(tái)中分別于每瓶中加入D600=1.0的菌懸液，混合均勻后最終形成最終菌含量約5×106mL-1的樣品，置于(30±2)℃、180 r·min-1的搖床中培養(yǎng)，每隔2 h在無(wú)菌條件下取樣3 mL，利用紫外分光光度計(jì)600 nm檢測(cè)吸光值，各濃度重復(fù)3次。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，總長(zhǎng)為24 h，各濃度下菌懸液的光密度值為縱坐標(biāo)，分別繪制不同濃度離子鈦影響下青枯病菌和野火病菌的生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

在Excel 2010中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用Sigmaplot對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板抑菌

利用平板帶藥法測(cè)定不同濃度光能變價(jià)離子鈦對(duì)煙草青枯菌和野火病菌菌落生長(zhǎng)的抑制情況。從圖1和圖2可以看出，離子鈦對(duì)青枯菌和野火病菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用具有顯著的濃度效應(yīng)，即隨著瓊脂平板中添加藥劑濃度的升高，對(duì)菌落生長(zhǎng)的抑制作用也隨之增強(qiáng)。隨著離子鈦濃度增加，菌落生長(zhǎng)所需時(shí)間越長(zhǎng)，菌落個(gè)數(shù)稍有減少，但是差異不顯著。當(dāng)離子鈦濃度為32 mg·L-1時(shí)，野火病菌在48 h時(shí)即生長(zhǎng)出菌落，而青枯菌則培養(yǎng)至96 h才出現(xiàn)菌落；當(dāng)離子鈦濃度為36 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)96 h后2種細(xì)菌均未長(zhǎng)成菌落。說(shuō)明離子鈦對(duì)煙草青枯菌和野火病菌均有較好抑制作用。

2.2 MIC和MAC

記錄培養(yǎng)48和96 h后病菌在含不同濃度離子鈦的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)48 h后平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)的處理濃度為MIC，96 h后無(wú)菌落生長(zhǎng)的處理濃度為MBC。從圖3和圖4可以看出，離子鈦對(duì)青枯菌的MIC和MBC分別為32 mg·L-1和36 mg·L-1，而對(duì)煙草野火病菌的MIC和MBC均為36 mg·L-1。

圖1 在含不同濃度光能變價(jià)離子鈦的培養(yǎng)基中青枯菌的生長(zhǎng)狀況

圖2 在含不同濃度光能變價(jià)離子鈦的培養(yǎng)基中野火病菌的生長(zhǎng)狀況

2.3 生長(zhǎng)曲線

根據(jù)最小抑菌濃度(MIC)設(shè)置4個(gè)濃度進(jìn)一步探索光能變價(jià)離子鈦在不同濃度下對(duì)煙草青枯病菌和野火病菌生長(zhǎng)的影響，由于野火病菌在32和36 mg·L-1時(shí)完全抑制病菌生長(zhǎng)，故本文只選擇32 mg·L-1及以下的濃度。結(jié)果(圖5)表明，在24 mg·L-1濃度下，煙草青枯菌和野火病菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期均被延后，最終生長(zhǎng)濃度也低于對(duì)照處理；而32 mg·L-1濃度時(shí)則完全抑制青枯病菌和野火病菌生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，光能變價(jià)離子鈦隨著濃度升高，對(duì)煙草青枯病菌和野火病菌的抑制作用增強(qiáng)。

圖3 不同濃度光能變價(jià)離子鈦培養(yǎng)48 h和96 h后對(duì)青枯菌菌落的生長(zhǎng)影響

圖4 不同濃度光能變價(jià)離子鈦培養(yǎng)48 h和96 h后對(duì)野火菌菌落的生長(zhǎng)影響

圖5 不同濃度光能變價(jià)離子鈦對(duì)青枯病菌(A)和野火病菌(B)生長(zhǎng)的影響

3 討論

煙草是吸食葉片的特殊作物，對(duì)農(nóng)殘要求甚高，高毒低效、安全無(wú)污染的農(nóng)藥是當(dāng)前綠色防控的必然趨勢(shì)。鈦對(duì)煙草有增產(chǎn)提質(zhì)作用[3-5]，對(duì)多種病菌有抑制作用[8-12,14]，且對(duì)環(huán)境和生物無(wú)害[16]，有望成為替代其他化學(xué)產(chǎn)品的新型農(nóng)藥。

本研究開(kāi)展了煙草青枯菌和野火病菌在不同濃度TIVL中的平板抑菌試驗(yàn)、MIC和MBC測(cè)定以及生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)。結(jié)果表明，TIVL對(duì)煙草青枯菌和野火病菌均有較好抑制作用，對(duì)煙草青枯菌的MIC和MBC為32 mg·L-1和36 mg·L-1，對(duì)煙草野火病菌MIC和MBC均為36 mg·L-1，且2種病菌在含有32 mg·L-1TIVL的培養(yǎng)液中均不能生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)初步表明，高濃度TIVL對(duì)煙草青枯病和野火病菌有抑制作用，其抑菌濃度分別為32和36 mg·L-1。此結(jié)果與范延芬等[12]對(duì)青枯病菌雷爾氏菌的研究結(jié)果大致一致，但是抑菌濃度稍有差異，可能與青枯病菌原液濃度和培養(yǎng)基不同有關(guān)系。雖然沒(méi)有相關(guān)研究開(kāi)展離子鈦與野火病菌的關(guān)系，但范延芬等[12]的實(shí)驗(yàn)中推測(cè)出TIVL具有廣譜抑菌效果。Vatansever等[14]開(kāi)展的研究表明，TiO2對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、霉菌及單細(xì)胞藻類(lèi)均有良好的殺滅效果，與本實(shí)驗(yàn)中高濃度的TIVL能抑制野火病菌生長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)。

雖然高濃度TIVL對(duì)煙草青枯病菌和野火病菌有抑制作用，但是其作用機(jī)理尚未明確，還需進(jìn)一步試驗(yàn)探索驗(yàn)證。但TIVL是廣譜性抑菌劑，在多種作物上均有較好效果，應(yīng)用前景良好，人們對(duì)用該物質(zhì)防治病蟲(chóng)害的研究將會(huì)日趨完善，這將為T(mén)IVL防治病蟲(chóng)害，解決農(nóng)藥污染，提高農(nóng)產(chǎn)品安全提供新思路。

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