響應面法優化天麻多糖的超聲提取工藝△

馬彥江，于蘭蘭，劉瑞霞，陳天朝*

(1.河南中醫藥大學第一附屬醫院 藥學部，河南 鄭州 450000；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院省級中藥炮制技術傳承基地，河南 鄭州 450000；3.河南省直第三人民醫院 藥劑科，河南 鄭州 450006；4.中牟縣中醫院 藥劑科，河南 中牟 451450)

天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖。味甘，性平，歸肝經。具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡之功能[1]。天麻含有天麻素、天麻苷元(對羥基苯甲醇)、天麻多糖、對羥基苯甲醛、檸檬酸、檸檬酸單甲酯、谷甾醇等，天麻多糖能有效調節機體免疫力，具有抗炎、延緩衰老、抗輻射、降低血壓的作用[2]。超聲提取技術作為一種新型中藥提取技術，具有省時、高效、能耗低等優點，已在中藥提取中廣泛應用[3]。響應面法(Response Surface Methodology，RSM)是集試驗設計、數理統計和最優化技術于一體的綜合應用方法[4]。與傳統的均勻設計與正交設計相比，響應面法具有精度高、次數少、數學模型預測性好等優點，且能反映各因素與響應值之間的關系[5-6]。故本實驗以天麻多糖提取率為響應值，運用Design-Expert軟件進行Box-Behnken響應面試驗設計，對天麻的超聲提取工藝進行優化，以期為天麻的深入開發與應用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；SG3300型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；DZKW-C電子恒溫水浴鍋(北京科偉永興有限公司)；Sartorius CP225D電子天平(德國賽多利斯公司)；LXJ-ⅡB離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 材料

天麻藥材購自安徽石田中藥飲片有限公司，經河南中醫學院第一附屬醫院藥檢室檢驗，符合2015版《中華人民共和國藥典》規定；D-無水葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201205)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 蒽酮-硫酸法測定天麻多糖的含量

2.1.1 標準曲線的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品2.77 mg，加無水乙醇定容至25 mL容量瓶中，即得對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，精密加入蒽酮-硫酸溶液(精密稱取蒽酮0.1 g，加入80%的硫酸100 mL溶解，搖勻)6 mL，搖勻，置100 ℃水浴中，加熱15 min，再放入冰水浴中冷卻15 min，以相應試劑為空白，在625 nm波長處測定吸光值。得回歸方程Y=37.906X-0.029(r=0.999 4，n=7)，結果標準曲線在0.002 8～0.019 4 mg·ml-1線性關系良好。

2.1.2 樣品前處理 將天麻塊莖在75 ℃時減壓干燥后將其粉碎，過80目篩，精密稱取藥材細粉1 g，加入一定量的水，在一定溫度下超聲提取一定時間，離心，上清液用三氯甲烷-正丁醇(3∶2)萃取2次，水層加4倍量95%乙醇，放入冰箱靜置過夜，濾過，殘渣用乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，干燥，即得天麻粗多糖。

2.1.3 多糖含量的測定 采用蒽酮-硫酸法[7-8]，將所得的天麻粗多糖加蒸餾水定容至50 mL，再精密吸取1 mL溶液，加蒸餾水定容至25 mL得樣品溶液。精密吸取1 mL置于10 mL試管中。按2.1.1項下操作，測定供試液的吸光度值，用下式計算天麻多糖提取率：

多糖提取率=[樣品濃度(mg·mL-1)×樣品體積(mL)×定容體積]/[樣品質量(g)×103]×100%

(1)

2.2 單因素試驗

參考相關文獻[9-13]，選定超聲提取溫度(℃)、提取時間(min)和液固比3個影響因素作為考察對象，每個因素設置5水平，以天麻多糖的超聲提取率為指標，初步考察各影響因素。

2.2.1 提取溫度對天麻多糖提取率的影響 設置固定液固比為20∶1，超聲提取60 min，考察不同的提取溫度對天麻多糖提取率的影響，結果見圖1。可知，在40～70 ℃，提取率隨溫度上升顯著提高，但當溫度大于70 ℃時，提取率增加不明顯，考慮到高溫對多糖的結構及活性的影響，提取溫度選定為70 ℃。

圖1 提取溫度對多糖提取率的影響

2.2.2 提取時間對天麻多糖提取率的影響 設置固定液固比為20∶1，提取溫度為60 ℃，考察不同的提取時間對天麻多糖提取率的影響，結果見圖2。可知，在45 min內，提取時間的增加，提取率隨之提高，但超過45 min后，提取率呈逐漸下降趨勢。這可能是提取時間的增加，部分多糖被破壞降解。故提取時間選定為45 min。

圖2 提取時間對天麻多糖提取率的影響

2.2.3 液固比對天麻多糖提取率的影響 設置固定提取時間60 min，提取溫度為60 ℃，考察不同料液比對天麻多糖提取率的影響，結果見圖3。

可知液固比為15∶1時，天麻多糖提取率明顯大于液固比為10∶1與5∶1時；與20∶1和25∶1時相比，差異不大。故液固比選定為15∶1。

圖3 液料比對天麻多糖提取率的影響

2.3 運用中心組合試驗優化前處理條件

根據Box-Benhnken試驗設計原理[3，5-6]，以超聲提取溫度(X1)、超聲提取時間(X2)、液固比(X3)3個因素為自變量，天麻多糖提取率為響應值，設計三因素三水平的響應面分析法對超聲提取工藝進行優化，共17個試驗點(14個為析因試驗，3個為中心試驗)。在單因素試驗結果的基礎上，選定各響應面因素水平，見表1，響應面分析結果見表2。

2.4 模型方程的建立與方差分析

應用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得回歸方程：Y=17.17+0.59X1+0.61X2+0.72X3-0.54X1X2-2.14X1X3+

0.37X2X3-1.69X12-4.23X22-3.66X32。對上述回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表1 響應面因素水平表

表2 響應面分析試驗結果

表3 天麻多糖方差分析結果

注：***表示P<0.001，差異極顯著；**表示P<0.01，差異高度顯著；*表示P<0.05，差異顯著。

由表3可知，一次項中提取時間(X2)、液固比(X3)對多糖提取率的線性效應顯著，各因素對多糖提取率的影響大小為X3>X2>X1；二次項中提取時間(X2)、液固比(X3)對多糖提取率的線性效應極顯著，提取溫度(X1)對多糖提取率的線性效應高度顯著；交互項中提取溫度與液固比(X1X3)對多糖提取率的線性效應極顯著。模型的調整確定系數為0.981 2，說明該模型能夠98.12%反映相應值隨自變量的變化，模型擬合程度較好。在本試驗設計范圍內，回歸方程的失擬項檢測P<0.000 1，極顯著；回歸方程顯著性檢測P<0.000 1，極顯著，證明響應曲面法優化的提取工藝提取天麻多糖是可行的。

2.5 響應曲面分析

響應面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應值的影響。天麻多糖超聲提取的二維等高線圖與響應曲3D圖譜見圖4。

注：A.提取溫度與提取時間；B.提取溫度與液固比；C.提取時間與液固比。圖4 各因素對天麻多糖提取率影響的二維等高線和三維響應面曲線圖

運用Design-Expert 8.0.6軟件優化所得的天麻多糖超聲提取最佳工藝：提取溫度78.54 ℃、提取時間48.06 min、液固比16.04∶1，在此條件下天麻多糖提取率的預測值為17.25%。

2.6 驗證實驗

為驗證響應面法所得結果的可靠性，對模型優化的工藝條件進行驗證。考慮到實驗的可行性與便捷性，選擇工藝參數：提取溫度78 ℃、提取時間48 min、液固比16∶1，重復實驗3次，計算天麻多糖提取率，求其平均值為17.22%。與理論預測值基本吻合。

3 討論

近年來對天麻的提取工藝研究主要有傳統水提取法、微波提取法、酶提取法、超聲提取法等。超聲提取與其他方法相比具有方法簡便、提取溫度低、時間短、效率高等優點[9，14]，同時避免了高溫高熱對中藥材生物活性的破壞，具有較好的抗氧化作用[15]。

本試驗運用三因素三水平的響應面分析法對天麻多糖超聲提取工藝的提取溫度、提取時間、液固比進行考察，建立了超聲工藝的二次多項式數學模型，經過驗證實驗證明是有效的。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：6.

[2] 陳維紅，羅棟.天麻素、天麻多糖藥理作用研究進展[J].中國藥物評價，2013，30(3)：132-134.

[3] 揭晶，趙越，王皓.Box-Behnken響應面法優化蘆筍總皂苷超聲提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20(8)：8-11.

[4] 張艷，李永哲.響應面法及其在藥學領域中的應用[J].吉林化工學院學報，2012，29(7)：20-26.

[5] 彭曉霞，路莎莎.響應面優化法在中藥研究中的應用和發展[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(19)：296.

[6] 余小翠，劉高峰.響應面分析法在中藥提取和制備工藝中的應用[J].中藥材，2010，33(10)：1651.

[7] 孟根達來，解紅霞，谷福根.正交試驗優選蒽酮-硫酸法測定蒙藥“那仁滿都拉”水溶性糖含量條件[J].中國藥師，2015，18(7)：1106-1109.

[8] 汪瑞敏，朱秋勁，張春花，等.不同提取方法對天麻多糖抗氧化活性的影響[J].食品科技，2015，40(3)：208-213.

[9] 張夢娟，徐懷德，安興國.天麻多糖的超聲波提取工藝研究[J].西北農林科技大學學報，2007，35(4)：91-95.

[10] 康冰亞，劉瑞新，桂新景，等.Box-Behnken響應面法優化大蒜油提取工藝[J].中國藥房，2017，28(1)：103-106.

[11] 朱潔平，李峰，深業壽.天麻多糖的提取工藝及含量測定研究[J].安徽農業科學，2012，40(18)：9648-9650.

[12] 朱曉霞，羅學剛.天麻多糖提取工藝優化[J].時珍國醫國藥，2007，18(4)4：906-907.

[13] 響應曲面法優化鐵皮石斛多糖提取條件[J].中國現代中藥，2011，13(9)：29-32.

[14] 劉濤，尼瑪卓瑪，尼珍，等.苯酚-濃硫酸法測定西藏天麻中多糖含量的條件優化[J].廣東農業科學，2011(8)：132-134.

[15] 汪瑞敏，朱秋勁，張春花，等.不同提取方法對天麻多糖抗氧化活性的影響[J].食品科技，2015，40(3)：208-213.