基于優(yōu)化顯微定量法的吳茱萸質量評價△

劉旭穎，王紋嵐，葛朝暉，陳聰慧

(臨沂大學 藥學院，山東 臨沂 276000)

中藥質量標準是國家藥品標準的重要組成部分。中藥成分復雜，品種繁多，現(xiàn)行的質量標準對藥品質量控制限于對大部分中藥的定性鑒別和少數(shù)中藥的某一單一化學成分的定量檢測，測量和控制中藥產品中的任何一種成分無法代表它的整體質量，可控性和專屬性尚不完善。以化學藥品質量控制方法為模式用于中藥產品不夠精準、完善。中藥的質量控制需要宏觀的、多因素的質量控制模式，來適應中藥這種基于多成分的協(xié)調、互補或制約、起著宏觀調控作用的特點。因此，單純依靠化學分析手段控制中藥質量與中藥的特點是不相符的，中藥質量控制需要多種檢測途徑的協(xié)同應用。

顯微定量法是根據(jù)顯微特征的專屬性和穩(wěn)定性，對中藥某一專屬特征進行定量分析，從而鑒定中藥真?zhèn)巍?yōu)劣的方法。中藥顯微定量法要求所研究的中藥應具有專屬性、可計數(shù)性的顯微特征；所用儀器簡單，操作簡便。該法可以作為化學方法的補充來檢測中藥質量。傳統(tǒng)顯微定量法雖然操作簡便，對顯微定量法的具體實驗設計都沒有經(jīng)過優(yōu)化，在實踐中并沒有被推廣使用。因此，本研究通過設計優(yōu)化實驗條件，得到優(yōu)化的顯微定量方法，從而對中藥進行質量評價。

吳茱萸(Euodiae Fructus)為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實，具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉之功效。本品粉末褐色，非腺毛2～6細胞，長140～350 μm，壁疣明顯，有的胞腔內含棕黃色至棕紅色物[1-2]。吳茱萸粉末中的非腺毛顯微特征明顯，不僅具有生物學穩(wěn)定的特性，而且數(shù)量眾多，易于觀察計數(shù)，見圖1。本實驗采用優(yōu)化的顯微定量方法[3]測定不同樣品吳茱萸粉末中非腺毛的顯微特征常數(shù)值大小；采用高效液相法對吳茱萸中的指標性化學成分檸檬苦素進行含量測定；用統(tǒng)計方法對不同吳茱萸樣品中的非腺毛的顯微特征常數(shù)值與化學成分檸檬苦素含量進行相關性分析，旨在通過測定不同吳茱萸樣品中的非腺毛的顯微特征常數(shù)值大小，判斷吳茱萸質量的優(yōu)劣，為評價吳茱萸的質量提供一種新的方法。通過本課題的研究，為中藥的質量鑒定開辟了新的研究方法，為中藥質量檢測體系進行了有益的充實。

圖1 吳茱萸非腺毛

1 儀器與材料

1.1 儀器

OLYMPUS CX-41生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AUX220萬分之一電子分析天平(日本島津公司)；KQ3200DV超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)；JK-APG-100高速萬能粉碎機(上海精學科學儀器有限公司)。

1.2 材料

檸檬苦素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：Z06M8C30368，純度>98%)。水合氯醛、甘油、磷酸、乙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)均為分析純；乙腈、四氫呋喃(天津市康科德科技有限公司)均為色譜純；實驗用水合氯醛試液依照2015年版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)一部附錄配制。

吳茱萸樣品來源于各大藥房及中藥材批發(fā)市場，由于產地、炮制加工、儲存條件等各種因素的不同均會導致質量差異。所有實驗樣品均經(jīng)臨沂大學藥用植物學教研室王文房教授鑒定為吳茱萸正品，具體來源見表1。

表1 吳茱萸樣品信息

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2 方法與結果

2.1 吳茱萸各樣品水分測定

按《中國藥典》2015年版通則0832第二法，測定1～8號樣品含水量，結果分別為11.26%、12.53%、13.15%、12.28%、11.82%、13.76%、12.63%、14.57%。

由水分測定結果可知，各樣品水分含量均低于15%，符合《中國藥典》要求。其中8號樣品(來源于臨沂中藥材批發(fā)市場)水分含量接近15%，可能是由于中藥材批發(fā)市場的貯存條件等影響，水分含量高于其他藥店樣品。

2.2 顯微定量法條件優(yōu)化設計

針對可能影響顯微定量法的實驗因素，以均勻設計實驗對顯微特征常數(shù)測定進行實驗條件優(yōu)選，優(yōu)化顯微定量方法。影響因素主要有樣品質量、樣品的粉碎粒度、混懸劑的用量。考慮到各因素的考察水平有所不同，故本實驗采用3因素6水平均勻設計法考察顯微定量法的優(yōu)化條件[4]，吳茱萸中非腺毛顯微定量法的均勻設計方案具體見表2。

表2 吳茱萸中非腺毛顯微定量法的均勻設計方案U6(63)

取1號吳茱萸樣品粉碎，分別過80目和100目篩。精密稱定75.0、100.2、125.1、150.1、174.9、200.1 mg共6份，用水合氯醛試液多次水飛，移入25 mL量瓶中，按表2加入相應甘油量，最后用實驗用水合氯醛試液定容。充分搖勻后，精密吸取0.02 mL進行顯微裝片，每份樣品溶液平行裝片50張，于顯微鏡下觀察非腺毛并計數(shù)。將所得的結果隨機分為5組，分別計算5組平均值的RSD。以每份樣品平均值的RSD為考察指標，實驗結果見表3。

表3 吳茱萸中非腺毛數(shù)值測定的均勻設計實驗結果(n=5)

根據(jù)實驗設計及結果，通過SPSS 17.0統(tǒng)計軟件得出均勻設計結果：Y=13.313-0.021X1-0.057X2，r=0.996；其中Y為RSD(%)；X1為樣品質量；X2為粉碎粒度；X3為加入甘油量。從輸出的方差分析結果可知，F(xiàn)=186.873，P=0.001，故線性回歸模型有統(tǒng)計學意義。

根據(jù)均勻設計結果方程：為使實驗設計結果Y值(RSD值)最小，選取X1、X2最大值：200 mg、100目為優(yōu)化條件；X3未進入方程，故根據(jù)實驗具體情況選擇。最終優(yōu)化結果：樣品稱樣量200 mg，粉碎過100目篩，加入甘油10 mL，Ymin=3.41%，數(shù)據(jù)精密度良好。

2.3 優(yōu)化顯微定量法的驗證實驗

取完全過100目篩的1號樣品粉末3份各200.0 mg，精密稱定，用水合氯醛多次研磨轉移至25 mL容量瓶中，加入甘油10 mL，最后用水合氯醛定容，充分搖勻后精密吸取0.02 mL樣品液，平行制片50張，于顯微鏡下觀察非腺毛并計數(shù)。將所得數(shù)據(jù)進行完全隨機化分為5組，計算每組的RSD值，結果見表4。

表4 吳茱萸中非腺毛數(shù)值測定的均勻設計驗證實驗結果(n=5)

對優(yōu)化的驗證實驗結果中，各份樣品的變異系數(shù)均與優(yōu)化條件給出的最小變異系數(shù)Ymin(3.41%)接近，說明由SPSS 17.0統(tǒng)計軟件給出的優(yōu)化條件是科學、準確的。

2.4 吳茱萸各樣品非腺毛顯微特征常數(shù)值測定

分別精密稱定吳茱萸8種樣品粉末，每種樣品各3份，按照均勻設計實驗得到的優(yōu)化顯微定量法條件，水合氯醛多次水飛，分別定容于25 mL量瓶中，精密吸取20 μL溶液，分別平行裝片50張，觀察非腺毛，計數(shù)，按公式(1)計算非腺毛顯微特征常數(shù)值(P)，取平均值，結果見表5。

P=(X×V)/(V′×m)

(1)

式中：m為樣品質量(mg，按干燥品計)；V為定量樣品混懸液總體積(mL)；P為定量樣品顯微特征常數(shù)(個·mg-1)；V′為蓋玻片下樣品混懸液體積(mL)；X為每片蓋玻片下樣品顯微特征數(shù)。

表5 各吳茱萸樣品中非腺毛顯微特征常數(shù)值測定結果

2.5 各樣品吳茱萸中檸檬苦素含量測定

采用高效液相色譜法對吳茱萸中檸檬苦素進行含量測定[2，5]。

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：[乙腈-四氫呋喃(25∶15)]-0.02% 磷酸溶液(35∶65)；檢測波長：215 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃。

2.5.2 對照品溶液的制備 取檸檬苦素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含檸檬苦素0.104 mg的混合溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取各吳茱萸樣品粉末(過三號篩)約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70% 乙醇25 mL，稱定質量，浸泡1 h，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，對照品及1號樣品的色譜圖見圖2。

根據(jù)峰面積計算各樣品吳茱萸中檸檬苦素含量，結果見表6。

注：A.檸檬苦素對照品；B.1號樣品；1.檸檬苦素.圖2 吳茱萸樣品及對照品HPLC圖

表6 各吳茱萸樣品中檸檬苦素含量測定

2.6 相關性分析

對吳茱萸各樣品中非腺毛的顯微特征常數(shù)(X)與檸檬苦素質量分數(shù)(%)(Y)做線性相關性分析，其結果：Y=0.006X-3.063，r=0.936，F(xiàn)=42.200，P=0.001；P<0.01表示有統(tǒng)計學意義。

結果表明，吳茱萸中檸檬苦素含量與各樣品中非腺毛顯微特征常數(shù)值有相關性(P<0.01)，且呈正相關，即樣品中非腺毛顯微特征常數(shù)值愈大，檸檬苦素含量愈大。

《中國藥典》2015年版規(guī)定：吳茱萸按干燥品計算，含檸檬苦素(C26H30O8)不得少于0.20%。根據(jù)所得到的回歸方程可知，含量達到《中國藥典》標準的吳茱萸粉末中非腺毛的顯微特征常數(shù)值應不少于543.83個·mg-1。

3 討論

根據(jù)優(yōu)化的顯微定量法，吳茱萸中檸檬苦素含量與各樣品中非腺毛顯微特征常數(shù)值的相關性有統(tǒng)計學意義，因此，在未提取的前提下，通過測定不同吳茱萸樣品中的非腺毛的顯微特征常數(shù)大小，可以判斷藥材吳茱萸質量的優(yōu)劣。根據(jù)所得到的回歸方程可知，含量達到《中國藥典》標準的吳茱萸粉末中非腺毛的顯微特征常數(shù)值應不少于543.83個·mg-1。因此，可以通過測定吳茱萸粉末中非腺毛的顯微特征常數(shù)值，即數(shù)值大于543.83個·mg-1，即可滿足《中國藥典》規(guī)定的吳茱萸質量。

經(jīng)過優(yōu)化的顯微定量法，科學、簡便，可以作為化學方法的補充來控制中藥質量。本研究為中藥的質量鑒定開辟了新的研究方法，為中藥質量檢測體系進行了有益的充實。筆者建議《中國藥典》對化學含量及顯微特征常數(shù)有統(tǒng)計學意義的中藥增加顯微特征常數(shù)值檢測方法。

[1] 康廷國.中藥鑒定學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：351.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：171.

[3] 陳聰慧，康廷國.金銀花顯微特征常數(shù)與化學成分相關性研究[J].中藥材，2011，34(9)：1373-1376.

[4] 劉明芝，周仁郁.中醫(yī)藥統(tǒng)計學與軟件應用[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：312.

[5] 劉湘丹，蔡嘉洛，鄒君華，等.吳茱萸及其炮制品中吳茱萸堿、吳茱萸次堿、和檸檬苦素成分含量對比分析[J].中醫(yī)藥導報，2016，22(3)：39-41.