尾加壓素Ⅱ在醛固酮誘導(dǎo)大鼠腎臟纖維化的表達(dá)和意義

洪奮玲，張旭升，黃戰(zhàn)軍，朱平先，蔡博治

腎臟纖維化［1］是指細(xì)胞外基質(zhì)異常增多和過(guò)度沉積，是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要原因，所有腎臟疾病最終均可發(fā)展為腎臟纖維化，因此，如何有效防治腎臟纖維化是臨床面臨的一個(gè)重要難題。醛固酮由腎上腺皮質(zhì)球狀帶合成和分泌的鹽皮質(zhì)類固醇激素，主要作用為調(diào)節(jié)血壓、電解質(zhì)和體液平衡；研究證實(shí)醛固酮是一個(gè)獨(dú)立的致纖維化因素，可引起體內(nèi)多器官纖維化改變，如心肌、血管纖維化和腎臟等［2，3］。 而尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）［4］是體內(nèi)最強(qiáng)的收縮血管的心血管活性肽，在腎臟亦有表達(dá)，并具有促多種細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成等生物學(xué)效應(yīng)，是否參與腎臟纖維化過(guò)程尚不清楚。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)觀察在正常鹽飲食狀態(tài)下，尾加壓素Ⅱ在單純?nèi)┕掏龆嗾T導(dǎo)的大鼠腎臟纖維化的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品約8周齡雄性SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，醛固酮購(gòu)自Sigma公司，其余為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及標(biāo)本收集雄性SD大鼠隨機(jī)分2組，每組8只：（1）正常對(duì)照組：給予等量的生理鹽水肌肉注射；（2）醛固酮組：醛固酮組采用醛固酮皮下注射（20 μg/d），常規(guī)飼養(yǎng)8周。2%戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，部分血標(biāo)本4℃離心10 min，分離血清，－70℃保存；剩下血標(biāo)本置入含有EDTA和抑肽酶的試管中，充分混勻，4℃離心10 min，分離血漿，－70℃保存。摘取腎臟，用冰生理鹽水沖洗后，部分組織石蠟包埋用于染色，剩下腎臟組織用錫箔紙包裹，－70℃保存待測(cè)。

1.3 腎臟組織Masson染色取大鼠腎臟石蠟塊，制作4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化、脫水，Masson復(fù)合染色液浸泡5 min，流水沖洗2次，0.2%醋酸水溶液稍洗， 流水沖洗 1次，1%磷鎢酸 5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，亮綠染色液5～10 min，0.2%醋酸水洗2次，經(jīng)脫水、透明、封片，在光鏡下觀察。

1.4 血清肌酐濃度測(cè)定取血清，送汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用肌氨酸氧化酶法檢測(cè)大鼠血清肌酐水平。

1.5 血漿和腎臟組織UⅡ含量的測(cè)定取血漿和腎臟組織標(biāo)本，送至北京華英生物研究所，采用放射免疫法檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件Graph Pad Prism4。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟Masson和HE染色比較Masson染色可見(jiàn)醛固酮大鼠腎小球、腎小管和腎間質(zhì)大量膠原蛋白沉積，明顯纖維化，HE染色可見(jiàn)醛固酮大鼠腎小球體積縮小，球體不規(guī)則、細(xì)胞增生和局部硬化，腎小管管壁水腫，管腔不規(guī)則，見(jiàn)圖1、2。

2.2 大鼠血清肌酐濃度、血漿和腎臟組織UⅡ含量比較醛固酮組血清肌酐濃度明顯高于正常組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

圖1 大鼠主動(dòng)脈Masson染色（×100）

圖1 大鼠主動(dòng)脈HE染色（×100）

表1 大鼠血清肌酐濃度、血漿和腎臟組織UⅡ含量比較

表1 大鼠血清肌酐濃度、血漿和腎臟組織UⅡ含量比較

與正常組比較，＊P＜0.01。

腎臟UⅡ含量（ng/g蛋白）正常組 8 40.35±2.34 2.27±0.82 0.19±0.15醛固酮組 8 86.13±3.33＊ 2.49±0.90 0.62±0.17＊組別 n 血清肌酐濃度（ng/L）血漿UⅡ含量（ng/L）

3 討論

腎臟纖維化是慢性腎病進(jìn)展為終末期腎衰的必然途徑，其基本病理過(guò)程是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)多地聚集、沉積及降解不足，多種細(xì)胞、活性因子共同參與這個(gè)過(guò)程，包括腎小球細(xì)胞系膜細(xì)胞活化、足細(xì)胞凋亡、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化以及多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，涉及多條信號(hào)通路如Smad、JAK/STAT信號(hào)通路等［5，6］，從而使腎臟組織受到嚴(yán)重破壞，影響腎功能。因此，如何有效防治腎臟纖維化具有重要的臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮是一種強(qiáng)的、獨(dú)立的致體內(nèi)多器官纖維化的因子，包括腎臟、心臟和血管組織等。醛固酮可導(dǎo)致心肌、血管組織纖維化，而且該效應(yīng)可被MR受體拮抗劑逆轉(zhuǎn)，可能涉及的分子機(jī)制包括氧化應(yīng)激反應(yīng)等［7］。該實(shí)驗(yàn)在正常鹽飲食狀態(tài)下，采用外源性醛固酮干預(yù)8周后，可見(jiàn)大鼠腎小球體積縮小，球體不規(guī)則、細(xì)胞增生和局部硬化，腎小管管壁水腫，管腔不規(guī)則，腎小球、腎小管和腎間質(zhì)大量膠原蛋白沉積，提示腎臟明顯纖維化，同時(shí)，血清肌酐明顯升高，表明腎臟濾過(guò)功能下降。并且，腎臟組織UⅡ的表達(dá)明顯上調(diào)，提示UⅡ參與腎臟纖維化的過(guò)程；然而，兩組血漿UⅡ含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示UⅡ是通過(guò)自分泌/旁分泌的方式發(fā)揮作用，而不是通過(guò)內(nèi)分泌的方式作用。

目前認(rèn)為促纖維化與抗纖維化因子的失衡是腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制。許多血管活性因子在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，如內(nèi)皮素、AngⅡ在腎臟損傷時(shí)表達(dá)明顯上調(diào)，從而增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth faltor，IGF-1）等促纖維化因子的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)形成，發(fā)生纖維化［8］。而UⅡ是目前最強(qiáng)的縮血管活性肽，與內(nèi)皮素、AngⅡ類似，在心血管組織、腎臟均有表達(dá)，主要是通過(guò)自分泌/旁分泌作用，具有促多種細(xì)胞增殖、動(dòng)脈粥樣硬化和膠原蛋白合成等生物學(xué)效應(yīng)，該作用是通過(guò)其特異受體（GRP14，UT）介導(dǎo)，涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括鈣離子、鈣調(diào)素、蛋白激酶C和絲裂素活化蛋白激酶等［9］。并且，促纖維化因子可以抑制抗纖維化因子的表達(dá)或者通過(guò)促纖維化因子之間的協(xié)同作用，從而促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常鹽飲食狀態(tài)下，單純給予醛固酮可導(dǎo)致腎臟纖維化，同時(shí)，腎臟UⅡ的表達(dá)上調(diào)，結(jié)合UⅡ有促膠原蛋白沉積等生物學(xué)效應(yīng)，提示UⅡ參與腎臟纖維化的進(jìn)程，這為腎臟纖維化的機(jī)制研究及防治提供新的思路和作用靶點(diǎn)，而可能涉及的分子機(jī)制和信號(hào)通路需進(jìn)一步研究明確。

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