鴨腸炎病毒和Ⅰ型鴨甲肝病毒熒光PCR快速檢測方法的建立與臨床應(yīng)用

楊金興，王友令，張玉霞，李莉，袁小遠(yuǎn)

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，濟(jì)南 250023）

0 引言

鴨腸炎病毒（Duck Enteritis virus，DEV）屬于皰疹病毒科皰疹病毒屬，病毒粒子呈球形，直徑為120～180 nm，有囊膜，病毒核酸型為DNA[1-2]。DEV可引起鴨、鵝等水禽的急性敗血性傳染病，發(fā)病率和死亡率都甚高，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的最為嚴(yán)重的傳染病之一[3]。鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis)的病原有2種：鴨甲肝病毒（Duck Hepatitis A virus，DHAV）和星狀病毒，DHAV分為3個血清亞型，星狀病毒分為2個亞型；其中DHAV的3個血清型相互獨立，無交叉免疫性[4]。

熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，可視實時監(jiān)控反應(yīng)過程，快速進(jìn)行結(jié)果的判定。DEV和DHAV是水禽的2種重要的危害性高的病原，兩者經(jīng)常單獨、或混合感染水禽，因此建立能夠快速準(zhǔn)確檢測DEV和DHAV的檢測方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

Ⅰ型鴨甲肝病毒的分離毒株QD16和鴨腸炎病毒的分離毒株LY16由山東省農(nóng)科院家禽研究所分離鑒定。

1.2 方法

1.2.1 引物（探針）設(shè)計

根據(jù)GenBank上近年來國內(nèi)DEV、Ⅰ型DHAV流行毒株序列，根據(jù)保守區(qū)域序列，利用Primer ExPress 2.0軟件分別設(shè)計實時熒光定量PCR引物以及TaqMan探針，探針熒光標(biāo)記物為FAM和MGB。所有引物由華大基因合成，PAGE plus級別純化。

表1 擴(kuò)增所用引物和探針引物

1.2.2 Real-time PCR方法的建立和特異性檢測

1.2.2.1 Real-time PCR的建立

鴨甲肝病毒QD16 RNA提取按照博日生物Simple RNA kit操作進(jìn)行，最后用20 μL DEPC水來溶解RNA，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT得到的cDNA置于-20℃保存。 鴨腸炎病毒LY16的DNA提取按照TaKaRa DNAiso試劑操作進(jìn)行，最后用30 μL超純水來溶解DNA。DNA置于-20℃保存。

在擴(kuò)增反應(yīng)體系中，對探針濃度、引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立了最佳的熒光定量PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。最終確定如下的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件：cDNA 5 μL或DNA 1 μL、2×PCR Mix(QIAGEN) 8 μL、Primer F/R各0.2 μL、Probe(50 pM/μL) 0.1 μL、補(bǔ)充水至16 μL。每個樣品做3份平行重復(fù)檢測。最佳反應(yīng)條件：95℃2 min，隨后94℃10 s、59℃10 s、72℃40 s 共進(jìn)行40 cycles。

1.2.2.2 特異性檢測

鴨副黏病毒、不同亞型的禽流感病毒、番鴨細(xì)小病毒、II型DHAV進(jìn)行上述Real-time PCR的檢測，通過擴(kuò)增曲線，判斷是否出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

1.2.3 敏感性檢測

將提取模板分別用分光光度計進(jìn)行OD值的測定，計算拷貝數(shù)。將模板10倍倍比稀釋，同樣進(jìn)行上述的熒光PCR檢測，確定最低檢測量，以判定檢測方法的敏感性。

1.2.4 臨床應(yīng)用

選取了2015年9月-2017年5月年間44份疑似DHAV和DEV水禽組織樣品和棉拭子進(jìn)行上述方法的檢測。同時采用病毒分離、常規(guī)PCR、后續(xù)的序列測定等進(jìn)行驗證。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR擴(kuò)增

DEV和DHAV的Real-time PCR擴(kuò)增均得到良好的擴(kuò)增曲線(見圖1、2)，擴(kuò)增曲線的Ct值分別為10.5、11.1。3份平行樣品的Ct值基本一致，說明檢測方法的重復(fù)性較好。鴨副黏病毒、禽流感病毒、番鴨細(xì)小病毒、II型DHAV均未出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，說明此方法具有明顯的特異性。

2.2 敏感性檢測

將DHAV的RNA模板進(jìn)行104倍稀釋，此時病毒的拷貝數(shù)為450 copies/μL可以獲得擴(kuò)增，而DEV病毒的敏感性更好，當(dāng)拷貝數(shù)為70 copies/μL就可以獲得擴(kuò)增。

2.3 臨床應(yīng)用

圖1 DEV的擴(kuò)增曲線

圖2 DHAV的擴(kuò)增曲線

2015年9月-2017年5月年間44份疑似DHV和DEV組織樣品進(jìn)行上述方法的檢測，檢測出了11份DHAV陽性樣品、9份DEV陽性樣品，另外檢測出1份DHAV和DEV混合感染的情況。以上檢測結(jié)果與后期病毒分離、序列分析的結(jié)果完全一致，證明此方法的準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)。

3 討論

鴨病毒性腸炎自1957年在我國首發(fā)以來，已廣泛流行于我國華南、華東等養(yǎng)鴨業(yè)較發(fā)達(dá)地區(qū)。近年來在北方也有小規(guī)模的流行發(fā)病，造成局部很大的經(jīng)濟(jì)損失。鴨甲型肝炎病毒可引起雛鴨的一種傳播迅速和高度致死性傳染病，死亡率很高，可達(dá)90%以上；鴨甲型肝炎病毒分為3個血清型，其中I型流行最廣、危害最大[4-5]。國內(nèi)學(xué)者也針對以上兩種病原進(jìn)行了相關(guān)的研究工作：獲得國內(nèi)流行毒株的全基因組序列、針對抗原蛋白的分子特征和功能研究等[6-7]。但是由于這2種病原在近年來出現(xiàn)新的流行特征，本文旨在應(yīng)用針對新流行毒株的FAM探針建立一種快速、特異、準(zhǔn)確的鑒別診斷鴨腸炎病毒DEV和I型鴨肝炎病毒DHAV的檢測方法[8]。在擴(kuò)增反應(yīng)體系中，對探針濃度、引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立了最佳的熒光定量PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，能夠擴(kuò)增出高度特異性片段、重復(fù)穩(wěn)定性好。因此，該方法可以及時對臨床樣品進(jìn)行診斷，從而減少疫病帶來的損失。

參考文獻(xiàn)

[1] 程安春, 汪銘書, 劉菲,等. PCR在鴨瘟臨床診斷和免疫及致病機(jī)理研究中的初步應(yīng)用[J]. 病毒學(xué)報, 2004(4):364-370.

[2] Mandal P S, Mukhopadhayay S K, Pradhan S, et al.Development of nested polymerase chain reaction-based diagnosis of duck enteritis virus and detection of DNA polymerase gene from non-descriptive duck breeds of West Bengal, India[J]. Veterinary World, 2017, 10(3):336-341.

[3] Dhama K, Kumar N, Saminathan M, et al. Duck virus enteritis (duck plague) - a comprehensive update[J]. The Veterinary quarterly, 2017, 37(1):57-80.

[4] Liu G, Wang F, Zheng N, et al. Genetic diversity of the VP1 gene of duck hepatitis virus type I (DHV-I)isolates from southeast China is related to isolate attenuation[J]. Virus Research, 2008, 137(1):137-141.

[5] Xu Q, Zhang R, Chen L, et al. Complete Genome Sequence of a Duck Hepatitis A Virus Type 3 Identified in Eastern China[J].Journal of Virology, 2012, 86(24):13848.

[6] Li J, Bi Y, Chen C, et al. Genetic characterization of Duck Hepatitis A Viruses isolated in China[J]. Virus Research,2013, 178(2):211-216.

[7] Zhang D, Lai M, Cheng A, et al. Molecular characterization of the duck enteritis virus US10 protein[J]. Virology Journal, 2017, 14(1):183-192.

[8] 孫曉軍，王曉藝，韓宏宇，等.鴨甲肝病毒與新型呼腸孤病毒復(fù)合RT-PCR檢測方法的建立[J].中國動物傳染病學(xué)報，2015，23(3):50-54.