12C6+輻射后兵豆根尖細胞染色體形態變異分析

強曉霞，張改相，張志國

（蘭州市第四中學，甘肅 蘭州 730050）

兵豆（Lens culinaris Medic.）俗稱小扁豆，染色體數目2n=14，豆科蝶型花亞科野豌豆族（Vicieae）兵豆屬（Lens）雙子葉一年生草本植物。兵豆含多種天然活性物質及維生素A、E、K等，營養豐富，食用價值高［1］。兵豆產量較低，輻射育種是選育高產新品種的有效途徑［2］。我們使用不同劑量的12C6+離子輻射兵豆干種子，并觀察輻射后M1代、M2代根尖細胞染色體形態差異。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試兵豆種子由甘肅省農業科學院作物研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 輻射處理 將兵豆干種子固定于有機玻璃盤樣品盤上，通過機械裝置對樣品進行旋轉。室溫條件下，利用蘭州重離子加速器裝置對干種子進行輻射，加速器的初始能量為80.55 MeV/u的12C6+離子。輻射劑量分別為0（CK）、10、30、60 Gy（gray），其中0 Gy為對照，即不進行種子處理。通過以下公式計算輻射劑量。

D［Gy］=1.6×10-9×LET［keV/um］×F［ions/cm2］×ρ-1［cm3/g］［3］，式中D表示吸收劑量；LET（linear energy transfer）表示傳能線密度；F表示單位面積的粒子；ρ表示密度。

1.2.2 種子萌發 將處理后的M1代和M2代種子隨機取30粒，放入底部墊有2～3層濾紙的大培養皿中，加入無菌水浸濕濾紙和種子，置25℃光照培養箱中，12 h光照培養，培養5～7 d，每天早晚各加水1次，根尖長1～2 cm時為最佳取樣狀態。

1.2.3 根尖染色體的取樣和觀察 切下根尖，長約1 cm，置于卡諾固定液（無水乙醇與冰醋酸的質量比為3∶1）中固定8 h，蒸餾水沖洗干凈后置于70%的乙醇中，4℃下保存備用。將固定好的根尖在5 moL/L的HCl溶液中水解3 min，再用1%的混合酶液（1%纖維素酶和1%果膠酶） 水解5 min，取出置載玻片上，滴卡寶品紅染色1～2 min，蓋好蓋玻片壓片。光學顯微鏡下觀察根尖分生區的細胞，并計數。

1.2.4 根尖染色體畸變率的計算 不同輻射劑量處理各觀察根尖30個，每個根尖隨機選擇細胞約50個，高倍顯微鏡下鏡檢、拍照，計數，統計包括含有染色體橋、微核、滯后染色體、游離染色體等的畸變細胞所占的比例。

圖1 12C6+輻射處理兵豆M1代根尖細胞染色體微核與染色體畸變

2 結果與分析

2.1 M1代兵豆根尖細胞核與染色體畸變類型及畸變率

未經輻射處理的兵豆根尖細胞染色體有絲分裂前期、中期、后期和末期，染色體形態均正常（圖1 A-D）。經過12C6+輻射處理的M1代兵豆根尖細胞，觀察到細胞有絲分裂前期單微核與雙微核（圖1 E、F箭頭表示）。中期染色體斷裂，分成兩部分（圖1 G）；中期滯后染色及染色體斷片（圖1 H、I），染色體未排列在赤道板中央（圖1 J）。有絲分裂后期染色體單橋與染色體雙橋（圖1 K、L）、染色體橋與微核粘連，后期單微核（圖1 M）。分裂期無規則排列的染色體（圖1 N）。在M1代根尖細胞中，出現了各種核與染色體畸變類型，如單微核、多微核、染色體橋連、滯后染色體和不均等分裂等。由表1可以看出，M1代根尖細胞中的染色體畸變與微核畸變率，隨著輻射劑量的增加而明顯增加，在0～60 Gy的輻射強度范圍內，60 Gy是最佳輻射劑量，出現各種突變的概率最高。微核一般來源于染色體斷片或由細胞核向外突出并延伸而成。微核率和染色體畸變率是檢測誘變源的生物效應和遺傳效應廣泛采用的遺傳損失評估指標，微核率及染色體畸變率的高低反映了致突變效應能力的大小，可以快速檢測染色體受損程度［4-5］。

表1 M1代兵豆根尖細胞染色體畸形率和微核率①

表2 M2代兵豆根尖細胞染色體畸形率和微核率

2.2 M2代兵豆根尖細胞核與染色體畸變率

觀察了兵豆M2代根尖細胞核及染色體形態。在M2代中，這種微核畸變率及染色體畸變率明顯減少（表2）。可能是由于輻射后代染色體重組、DNA自身修復等作用，減少了輻射對后代的染色體損傷。但仍然有一部分染色體損傷和變異是不可恢復的，如DNA片段的缺失，堿基增加、顛換、異位及染色體缺失、倒位等，從而造成了后代表型多樣性［6-7］。

3 小結

在0～60 Gy重離子12C6+輻射范圍之內，輻射誘變能引起兵豆根尖細胞核及染色體形態異常，并隨著輻射劑量的增加，微核畸變率及染色體畸變率明顯升高。60 Gy劑量輻射出現各種核及染色體變異的概率最高。

參考文獻：

［1］MONDAL M M A， PUTEH A B， MALEK M A， et al.Contribution of morpho-physiological traits on yield of lentil （ Lens culinaris Medik L.）［J］.Australian Journal of Crop Science， 2013（ 7）： 1167-1172.

［2］ZHOU W Q， WU Z L， ZHANG Y C， et al.Stable inheritance of excellent agricultural traits induced by12C6+heavy-ions in lentil（ Lens culinaris Medik.） ［J］.Czech Journal of Genetics and Plant Breeding， 2015， 51（ 1）：29-35.

［3］NAGATOMI S， Characteristics of chrysanthemum mutants regenerated from in Vitro explants irradiated with12C5+ion beam［J］.Tokyo Internatinal Exhibition Center，1998， 12： 8-10.

［4］袁成凌，余增亮.低能重離子生物學研究進展［J］.輻射研究與輻射工藝學報，2004，22（1）：1-7.

［5］劉忠祥，徐大鵬，姚澤恩，等.252Cf裂變中子輻射玉米種子生物學效應初步研究［J］.華北農學報，2016， 31（ 5）： 17-77.

［6］SHIKAZONO N， SUZUKI C， KITAMURA S， et al.Analysis of mutations induced by carbon ions in Arabidopsis thaliana［J］.Journal of Experimental Botany，2005， 56： 587-596.

［7］TANAKA A， SHIKAZONO N， HASE Y.Studies on biological effects of ion beams on lethality，molecular nature of mutation， mutation rate， and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants［J］.Journal of Radiation Research， 2010， 51： 223-233.