AHLL納米粒制備工藝的研究

李 瑩，方旭波，周劍忠，吳佳麗，黃 瓊，劉小莉，王 英

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京210014；2.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山316022）

丙氨酸－組氨酸－亮氨酸－亮氨酸（Ala－His－Leu－Leu，簡稱AHLL）是一種從泥鰍蛋白酶解物中提取的活性四肽，Li等發現其具有較高的抑制血管緊張素轉化酶活性［1］，對高血壓等心血管疾病有輔助治療作用［2－3］。AHLL人工合成簡單，成本較低，具有較高的應用價值。然而前期研究表明，AHLL在腸道內會被消化系統中的胰酶降解，導致其血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，簡稱ACE）抑制活性顯著下降［4］。

納米粒遞釋系統通過將活性物質包封在納米粒內部結構中，從而保護藥物不受到生物及化學降解。聚乳酸－羥基乙酸共聚物［poly（lactic－co－glycolic acid），簡稱 PLGA］是由2種單體——乳酸和羥基乙酸隨機聚合而成的，是一種可降解的功能高分子有機化合物。PLGA具有良好的生物相容性，無毒可食用，且具有良好的成囊和成膜性能，被廣泛應用于食品中活性物質的包埋、制藥、醫用工程材料和現代化工業領域［5－7］。PLGA通過美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，簡稱FDA）認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典［8］。忻娜等采用超臨界二氧化碳抗溶劑法成功制備聚乳酸－羥基乙酸共聚物包埋姜黃素的納米顆粒，姜黃素包埋率達93.89%［9］；Patel等采用 PLGA包埋色甘酸鈉，有效提高了其腸道滲透效果，色甘酸鈉－PLGA納米粒的腸細胞滲透率提高了4倍［10］；金啟星等以PLGA微球包載牛血清白蛋白，實現了牛血清白蛋白體外釋放速度的有效控制［11］。本研究以PLGA作為載體，對ACE抑制肽AHLL進行活性包埋，制備AHLL的PLGA納米粒，并以包封率為評價指標，研究乳化劑濃度、水油體積比、聚合物濃度、活性肽濃度等工藝因素對納米粒質量的影響。此外，通過掃描電鏡觀察納米粒的表面形貌，測定目標產物的粒徑及電位，評價納米粒體系的穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AHLL（純度＞97%），上海強耀生物科技有限公司。聚乳酸 －羥基乙酸共聚物［m乳酸（L）∶m羥基乙酸（G）＝50∶50，分子量＝15 000］，濟南岱罡生物工程有限公司；聚乙烯醇，上海源葉生物科技有限公司；丙酮、三氯乙酸，成都市科龍化工試劑廠；乙腈（色譜純），江蘇漢邦公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

UniCen MR冷凍離心機，德國Herolab公司；500型精密電子天平，意大利BEL公司；SZ－1漩渦混勻器，江蘇省金壇市江南儀器廠；78－2型雙向磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市中大儀器廠；KQ－400KDB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FDU－1200冷凍干燥機，日本東京Rikakikai公司；EVO LS10掃描電鏡，德國卡爾蔡司公司；Malvern Nano ZS90粒度電位儀，英國Malvern儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 AHLL納米粒制備 準確稱取一定量的AHLL和載體材料PLGA，將其分別溶于丙酮中，混合后構成油相，在攪拌條件下將油相緩慢滴加到含有聚乙烯醇的水溶液中，超聲乳化一段時間，將所得的乳液在自然條件下置于恒溫磁力器上攪拌過夜，揮發除去有機溶劑，將所得納米粒混懸液于4 000 r／min低速離心除去大顆粒雜質，將上懸液于12 000 r／min高速冷凍離心30 min，用蒸餾水洗滌3次，最后將所得沉淀超聲分散在蒸餾水中，冷凍干燥48 h，即得納米粒粉末，于4℃保存于真空干燥箱中備用。

1.3.2 納米粒的粒徑分布和Zeta電位 稱取一定量的活性肽PLGA納米粒粉末，超聲分散于蒸餾水中，稀釋一定的倍數，采用激光散射粒度電位儀測定納米粒的粒徑、粒度分布及Zeta電位。

1.3.3 納米粒的表面形貌 取少量AHLL納米粒粉末，將其均勻灑在貼有導電膠的樣品臺上，在真空下對樣品表面進行噴金處理，置于掃描電鏡下觀察其形貌并拍照。

1.3.4 載AHLL納米粒包封率的測定 納米粒的藥物包封率是指單位體積或質量納米粒中被載入納米粒中的藥物量與體系中藥物總量之比。用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡稱 HPLC）方法檢測納米粒洗液中AHLL的含量，計算包封率：

包封率＝（AHLL的投料量－未被包封的AHLL含量）／AHLL的投料量×100%。

1.3.5 高效液相色譜法測定AHLL含量 色譜柱：4.6 mm×150 mm ZORBAX XDB－C18（美國安捷倫科技有限公司）。檢測條件：流動相A，100%乙腈［含體積分數0.1%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，簡稱 TFA］，流動相 B，H2O（含體積分數0.1%的 TFA）；洗脫條件為 0～10 min，0～20%A，10～30 min，20%～40%A，30～35 min，40% ～100%A；檢測波長為215 nm，流速為0.5 mL／min，柱溫為35℃。用純度為99%的AHLL標準品建立標準曲線。150μL樣品經0.45μm膜過濾，取20μL濾液進樣，根據標準曲線計算樣品中的AHLL含量。

1.4 數據統計方法

試驗數據以“平均值±標準差”表示，用SPSS 13.0統計軟件做方差分析（analysis of variance，簡稱ANOVA），分析比較各組之間的差異性。

2 結果與分析

2.1 乳化劑濃度對納米粒制備效果的影響

配制一系列不同濃度的聚乙烯醇溶液作為水相，以聚合物PLGA為載體材料，以活性肽AHLL為活性包載物，設制備中的其他組分用量不變，研究乳化劑濃度對其包封率的影響。由圖1可以看出，隨著乳化劑聚乙烯醇濃度的增加，納米粒的包封率呈現出先增大后減小的趨勢，這是由于當聚乙烯醇的濃度低于臨界膠束濃度時，油相無法在水相中乳化分散，導致無法形成納米粒；當聚乙烯醇的濃度增大到臨界膠束濃度時，油相液滴表面的乳化劑分布達到飽和，此時納米粒具有較大的包封率；隨著聚乙烯醇濃度的繼續增大，體系的黏度也增大，乳滴碰撞的概率提高，團聚現象增多，造成納米粒的包封率逐漸降低。因此，在AHLL納米粒制備過程中，乳化劑聚乙烯醇的最佳濃度為0.02%。潘藝茗在研究姜黃素納米粒時，同樣在乳化劑維生素E聚乙二醇1000琥珀酸（TPGS）的臨界膠束濃度為0.03%左右時制備的納米粒的包封率較高［12］。

2.2 水油相體積比對納米粒制備效果的影響

設水相體積不變，改變油相體積，同時固定油相中PLGA、AHLL用量，采用乳化溶劑揮發法制備納米溶液，研究水油相體積比對其包封率的影響。由圖2可以看出，隨著水油相體積比的增加，AHLL納米粒的包封率呈現先提高后降低的趨勢。在低水油相比下，油相相對水相的濃度高，在水相中擴散困難，體系黏度高，容易發生團聚，形成較大的顆粒，影響納米粒的產率和對活性物質的包封，因此包封率相對較低。由于本試驗中固定丙酮中的PLGA、AHLL用量不變，所以當水油相體積比較大，丙酮用量較小時，油相中物質的濃度增加，油相液滴在水相中較難分散，從而導致納米粒的產率降低，對AHLL的包封效果變差，包封率明顯減小。因此，油相相對體積過高或過低都會造成包封率的降低。油相的用量存在1個臨界值，低于或高于這個值，納米粒的包封率均會降低。可以看出，在AHLL納米粒制備過程中，水相∶油相的臨界值為15∶1，此時制備的納米粒的包封率最高。

2.3 聚合物濃度對納米粒制備效果的影響

固定其他條件不變，改變油相中PLGA的濃度，研究聚合物濃度對AHLL納米粒包封率的影響。從圖3可以看出，隨著聚合物PLGA濃度的增加，納米粒的包封率呈現先增大后減小的趨勢，可見包封率并不是隨著聚合物濃度的增加而增加的，研究顯示，PLGA在第一相中其包封率隨著濃度升高而升高［13］。Mao等采用O／W乳化溶劑揮發法制備阿曲生坦微球，當控制PLGA的濃度＜30%時，微球包封率與PLGA濃度才呈現正相關關系［14］。這主要是因為，當聚合物PLGA濃度很小時，可形成AHLL納米粒的數量較少；隨著PLGA濃度的逐漸增加，AHLL納米粒的產率也隨之增大，對AHLL的包封率會逐漸升高。然而，當PLGA濃度過大時，油相黏度明顯增大，在水相中分散困難，容易發生團聚而形成較大的顆粒，會嚴重影響納米粒的產率和對AHLL的包封，導致AHLL納米粒的包封率減小。由圖3可以看出，在PLGA濃度為20%～30%的范圍內，納米粒對AHLL的包封率較高。

2.4 AHLL濃度對納米粒制備效果的影響

固定制備過程中其他條件不變，改變AHLL在油相中的濃度，在相同試驗條件下制備AHLL的PLGA納米溶液，測定其包封率。由圖4可以看出，隨著AHLL濃度的增大，AHLL納米粒的包封率逐漸下降。這是由于AHLL濃度增大時，包裹單位AHLL的聚合物分子數量相對變少，載體包裹AHLL的概率降低，從而導致AHLL包封不完全，納米粒對AHLL的包封率降低。然而，包載物濃度過低時，將造成AHLL在生物體內的靶向作用不明顯，綜合比較后，選擇AHLL濃度為2.0%。

2.5 AHLL納米粒粒徑和粒度分布

納米粒粒徑的大小及其分布均勻程度與其穩定性和包封率有關，也會直接對納米粒在生物體內的行為造成影響。AHLL納米粒的粒徑及其分布如圖5所示，可見空白納米粒的平均粒徑為 186.7 nm，AHLL納米粒的平均粒徑為223.6 nm。可以看出，納米粒對AHLL的包封作用使得AHLL納米粒比空白納米粒的粒徑有所增大，同時2種納米粒的粒徑分布均較窄，且較為均一。

2.6 AHLL納米粒的表面電位分析

納米粒作為一種活性物質的輸送體系，其表面電位是體系考察的重要因素之一。納米粒表面電位的大小體現了納米粒膠體溶液的穩定性，表面電位的絕對值越大，則納米粒表面同種電荷的相互排斥力也就越大，納米粒越不容易發生團聚現象，能更加穩定地分散在溶液中，整個納米粒體系的穩定性也就越好。測定載有AHLL的PLGA納米粒和空白納米粒的表面電位，由結果可知，載有AHLL的PLGA納米粒的平均電位為 －28.7 mV，空白 PLGA納米粒的平均電位為－25.1 mV，表明AHLL經納米粒包裹后，比空白納米粒的電位有所提高，具有更佳的納米粒體系穩定性。

2.7 AHLL納米粒的表面形貌

納米粒表面形貌特征對其在生物體內的靶向和分布會產生一定影響。載有AHLL的納米粒粉末，經噴金處理后，置于掃描電鏡下放大不同倍數后對其表面形貌進行觀察。由圖6（5 000×）、圖7（10 000×）可以看出，載有 AHLL的 PLGA納米粒為形狀均勻的球形，表面光滑，分散也較為均勻。

3 結論

采用乳化溶劑揮發法制備AHLL的PLGA納米粒的最優條件如下：在室溫下，將油相緩慢滴加到水相中，勻速攪拌，油相中聚合物PLGA濃度為25%，AHLL濃度為2.0%，水相中乳化劑聚乙烯醇的臨界膠束濃度為0.02%，水油相體積比（W∶O）為15∶1，超聲乳化15 min，在自然條件下揮發過夜。此時制備的納米粒為表面光滑且分散較均勻的球形，平均粒徑小，包封率大。載有AHLL的PLGA納米粒比空白納米粒的平均電位有所提高，具有更加穩定的納米粒體系。

參考文獻：

［1］Li Y，Zhou JZ，Huang K H，etal.Purification of a novel angiotensin I－converting enzyme（ACE）inhibitory peptide with an antihypertensive effect from loach（Misgurnus anguillicaudatus）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（5）：1320－1325.

［2］李 瑩，曾曉雄，周劍忠，等.泥鰍ACE抑制肽的體外活性研究［J］.食品工業科技，2012，33（17）：127－130.

［3］Li Y，Zhou JZ，Zeng X X，etal.A novel ACE inhibitory peptide Ala－His－Leu－Leu lowering blood pressure in spontaneously hypertensive rats［J］.Journal of Medicinal Food，2016，19（2）：181－186.

［4］李 瑩.泥鰍蛋白源ACE抑制肽的酶法制備及其降壓活性研究［D］.南京：南京農業大學，2012.

［5］馬桂蕾，趙順新，金 旭，等.葉酸修飾星型端氨基PEG－PLGA納米膠束的制備及腫瘤細胞靶向作用［J］.高等學校化學學報，2012，33（8）：1854－1859.

［6］薛 靜.聚（乳酸－羥基乙酸）共聚物納米粒藥物載體的制備及性能研究［D］.廣州：華南理工大學，2011.

［7］陳紅麗，呂潔麗，晏 杰，等.殼聚糖修飾的PLGA納米粒作為蛋白多肽類藥物載體的研究［J］.功能材料，2011，42（2）：202－205.

［8］李潔麗，鄭春麗，劉建平，等.多柔比星PLGA納米粒的處方工藝優化及體外釋藥行為研究［J］.藥學學報，2013，48（5）：759－766.

［9］忻 娜，Zabihi F，賈競夫，等.響應面法優化超臨界抗溶劑法制備姜黃素 －PLGA復合顆粒［J］.食品科學，2014，35（18）：1－5.

［10］Patel R R，Chaurasia S，Khan G，et al. Cromolyn sodium encapsulated PLGA nanoparticles：an attempt to improve intestinal permeation［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2016，83：249－258.

［11］金啟星，成曉嵐，羅宇燕，等.工藝因素對復乳法制備的載牛血清白蛋白PLGA微球形態與釋放行為的影響［J］.廣東藥學院學報，2014，30（5）：539－543.

［12］潘藝茗.PLA／PLGA－姜黃素納米粒的制備與性能研究［D］.廣州：華南理工大學，2012.

［13］孫美麗，班俊峰，黃思玉，等.PLGA微球載藥量和包封率的影響因素及控制［J］.廣東藥學院學報，2011，27（6）：643－648.

［14］Mao S，Shi Y，Li L，et al.Effects of process and formulation parameters on characteristics and internalmorphology of poly（d，llactide－co－glycolide）microspheres formed by the solvent evaporation method［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2008，68（2）：214－223.