纈草揮發油的微波輔助提取工藝及其抗氧化活性

李小紅，吳地堯，李 安，張靜宜，吳德智

（1.貴州理工學院，貴州貴陽550003；2.江西中醫藥大學，江西南昌330004）

纈草（Valeriana officinalis L.）為敗醬科纈草屬多年生草本植物，具有鎮靜、催眠和抗驚厥等神經系統作用，同時具有調節循環系統和抗氧化、抗腫瘤等藥理活性［1］。纈草含有揮發油、黃酮類、環烯醚萜類、生物堿類等活性成分，其中揮發油是纈草的主要活性成分。目前，纈草揮發油的提取方法主要是水蒸氣蒸餾法，但該方法存在能耗高、提取時間長、提取效率低、揮發油外觀與氣味發生明顯變化等不足。近年來興起的超臨界流體萃取已經應用于纈草揮發油的提?。?］，該方法高效、得油率高、安全環保，但成本較高。目前微波輔助提取技術已廣泛應用于揮發油提取［3－6］，該法能在較短時間完成提取，減少了揮發油因長時間高溫所造成的含氧化合物熱解、水解、氧化等，具有能量利用率高、提取速率快、得率高、可維持揮發油的天然品質等特點［7］。本研究以纈草揮發油提取率為主要指標，通過單因素及Box－Behnken響應曲面試驗優化微波輔助水蒸氣蒸餾提取工藝條件，并通過還原力、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（簡稱DPPH）自由基清除力以及羥自由基清除力的測定，與傳統水蒸氣蒸餾法所得揮發油的抗氧化能力進行比較，以期為纈草的藥用和食用產品研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

纈草根莖，采自貴州省江口縣纈草種植基地。正己烷、無水乙醇、鐵氰化鉀，國藥集團化學試劑有限公司；所用其他試劑均為分析純。

Scientz－IIDM微波光波超聲波萃取儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；FA1004B電子天平，上海越平科學儀器有限公司；旋轉蒸發器，上海上天精密儀器有限公司；UV－2550型紫外－可見分光光度計，梅特勒－托利多國際股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 纈草揮發油的提取工藝 采用一般水蒸氣蒸餾法對纈草揮發油進行提取。稱取適量樣品，加一定量NaCl溶液，振搖混合后浸泡一定時間。連接揮發油測定器與回流冷凝管，保持微沸，蒸餾一段時間后停止加熱，靜置，取揮發油，加無水硫酸鈉過夜，過濾得纈草揮發油提取物備用，與微波輔助提取的纈草揮發油進行抗氧化活性的比較。

參照譚承佳等的微波輔助提取揮發油的方法［8］對纈草揮發油進行提取。取適量纈草，將正己烷按一定比例加入圓底燒瓶內，置于改良的微波爐腔內。根據試驗要求設定微波功率與時間，回流提取后冷卻至室溫，抽濾，收集濾液，適量濃縮，水浴蒸干得到微波提取物。再采用上述一般水蒸氣蒸餾法收集纈草揮發油，計算揮發油得率：

1.2.2 單因素考察微波輔助提取工藝 本試驗針對微波功率（150、300、450、600、750 W）、提取時間（10、15、20、25、30、35 min）、液料比（4 mL∶1 g、6 mL∶1 g、8 mL∶1 g、10 mL∶1 g、12 mL∶1 g）3個因素，保持其中2個變量固定不變，對另1個變量進行單因素試驗，以揮發油提取率為指標，以確定Box－Behnken響應曲面設計所需的水平范圍。

1.2.3 Box－Behnken響應曲面法優選纈草揮發油提取工藝在單因素試驗的基礎上，選取微波功率、提取時間、液料比3個對揮發油提取率影響較大的因素，用 Design－Expert 8.0.6提供的Box－Behnken試驗，以揮發油提取率為指標優化提取工藝參數，試驗設計如表1、表2所示。

表1 Box－Behnken響應面試驗因素與水平

表2 纈草揮發油提取的Box－Behnken響應曲面試驗設計及評價指標

1.2.4 DPPH自由基清除能力測定 參照 Kim等的方法［9］進行DPPH自由基清除能力的測定。以無水乙醇為溶劑，將揮發油配制成濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg／mL的溶液備用。精確吸取上述不同濃度的溶液300μL，與2 mL 0004%DPPH溶液充分混合后于室溫靜置20min，在517 nm處測其吸光度D517nm（1）。以不加提取液的DPPH為空白對照，以維生素C為陽性對照，測定溶液在517 nm處的吸光度D517nm（0）。精確吸取300μL上述不同質量濃度的揮發油溶液，分別與2 mL無水乙醇混合均勻后，以無水乙醇為對照，測定各溶液在517 nm處的吸光度D517nm（2）。用同樣的方法對水蒸氣蒸餾法提取的揮發油DPPH自由基清除能力進行測定，計算公式如下：

1.2.5 鐵氰化鉀還原法測定還原力 參照劉水英等的方法［10］對還原力進行測定。配制不同濃度的揮發油樣品溶液。取1.5 mL樣品，加入1.5 mL pH值6.6的磷酸鹽緩沖液和1.5 mL六氰合鐵酸鉀溶液，混勻后于50℃恒溫放置20 min，快速冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，于3 000 r／min離心10 min，取1 mL上清液再加入1 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻并靜置后，于700 nm處測定吸光度，以吸光度表示還原能力，以維生素C為陽性對照。用同樣的方法對水蒸氣蒸餾法提取的纈草揮發油的還原力進行測定。

1.2.6 羥自由基清除率 參照陳美珍等的方法［11－12］進行羥自由基清除力的測定。配制不同濃度的揮發油樣品溶液，取1.5 mL樣品，分別加入 1.0 mL 2.5 mmol／L水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol／L FeSO4溶液和 2.0 mL蒸餾水，充分混勻，加入1.0 mL 5 mmol／L H2O2，先置于 37℃恒溫水浴鍋中反應30 min，再于510 nm處測定其吸光度，以蒸餾水作為空白參比，以維生素C作為陽性對照。用同樣的方法對水蒸氣蒸餾法提取的纈草揮發油的羥自由基清除率進行測定，具體公式如下：

式中：D510nm（0）為空白對照吸光度；D510nm（2）為加 H2O2樣品溶液吸光度；D510nm（1）為不加H2O2樣品溶液吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素考察揮發油微波輔助提取工藝

2.1.1 微波功率對揮發油提取率的影響 由圖1可知，隨著微波功率的增加，揮發油提取率呈現先上升后下降的趨勢。當微波功率為300W時，揮發油提取率為（5.27±0.27）%。分析其原因，主要由于當功率升高時，溫度過高，低沸點物質隨介質沸騰而有所損失。因此，選定150～450 W為響應面設計的最佳水平。

2.1.2 提取時間對揮發油提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時間的增加，揮發油提取率呈先上升后穩定在一定水平再下降的趨勢。當提取時間為20～30 min時，提取率穩定在（4.75±0.16）%左右，當繼續增加提取時間，揮發油被破壞或從介質揮發從而出現提取率下降的趨勢。因此，選定15～30 min為響應面設計的提取時間范圍。

2.1.3 液料比對揮發油提取率的影響 由圖3可知，隨著液料比的增加，揮發油提取率先上升后穩定在一定水平，沒有明顯提高。當液料比為8 mL∶1 g時，提取率穩定在（5.7±0.25）%左右。主要是因為提取液的增加可使纈草與提取溶劑充分接觸，有利于揮發油的浸出。當液料比超過8mL∶1 g時，揮發油的提取基本達到飽和狀態。因此，選定（6～10 mL）∶1 g為響應面設計的水平。

2.2 Box－Behnken響應曲面設計優化揮發油微波輔助提取工藝

采用 Design－Expert8.0.6提供的 Box－Behnken試驗對各因素進行擬合，得到多元回歸方程：

R提取率＝－6.100 5＋0.043 7A＋0.091 4B＋0.832 3C－3.555 5×10－5AB＋2.333 3×10－4AC＋0.020 8BC－6.790 0×10－5A2－4.893 3×10－3B2－0.085 1C2。

對揮發油提取率的回歸模型進行方差及顯著性分析的結果見表3?？梢钥闯觯撃Ｐ头匠逃袠O顯著影響（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＝0.061 2＞0.05），說明在本試驗條件下，該回歸模型所考察的因素足以反映試驗中各提取工藝參數對揮發油提取率的影響。R2＝0.988 0＝0.972 5，說明回歸模型與試驗值擬合均較好，可用于揮發油提取率的理論推測和分析，各因素影響大小依次為微波功率＞提取時間＞液料比。由F檢驗結果可知，一次項中微波功率、提取時間對揮發油的提取率具有極顯著影響（P＜001），交互項中提取時間與液料比之間的交互作用對揮發油提取率具有極顯著影響（P＜0.01）；在二次項中微波功率、提取時間、液料比均對揮發油提取率具有極顯著影響（P＜001），其他因素之間影響不顯著。表3的結果與圖4中響應面圖反映的各因素間的交互作用吻合。

表3 試驗結果方差分析

由Design－Expert8.0.6軟件得出，揮發油提取的最佳工藝參數是微波功率326.30 W、提取時間25.48 min、液料比8.57 mL∶1 g，在此條件下揮發油的提取率為5.89%。為便于生產試驗需求，設定微波功率為330 W，提取時間為25 min，液料比為8.6 mL∶1 g，進一步進行驗證試驗，得出揮發油提取率為（5.92±0.07）%。該值與預測值比較近，因此選取微波功率330W、提取時間25 min、液料比8.6 mL∶1 g作為微波輔助提取纈草揮發油的工藝參數。

2.3 不同提取工藝提取的纈草揮發油抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定結果 由圖5可知，水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發油對DPPH自由基均有較強的清除能力，且纈草揮發油濃度與DPPH清除率存在正相關關系，微波輔助提取的清除能力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當纈草揮發油濃度為0.5 mg／mL時，微波輔助提取法的清除率為80.9%，而水蒸氣蒸餾法的清除率為70.2%。

2.3.2 還原力測定結果 吸光度與樣品的還原力具有正相關關系，吸光度越大，樣品的還原力越強。由圖6可知，水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發油均具有較強的還原能力，說明該纈草揮發油也具有較強的抗氧化能力。在測定的質量濃度范圍內，纈草揮發油的還原力隨著濃度的升高而增強，且微波輔助提取的纈草揮發油還原力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當纈草揮發油濃度為0.5 mg／mL時，微波輔助提取法的吸光度為1.35。

2.3.3 羥自由基清除率 由圖7可知，水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發油對羥自由基均有較強的清除能力，隨著揮發油濃度的增加，清除率也隨之提高，微波輔助提取的清除能力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當纈草揮發油濃度為0.5 mg／mL時，微波輔助提取法的清除率為78.9%，而水蒸氣蒸餾法的清除率為73.1%。

3 結論

響應面法已廣泛應用于化工、食品、農林、冶金等各領域，具有試驗次數少、設計簡便等優點。本研究以纈草為主要原料，采用Box－Behnken響應曲面設計，對其揮發油微波輔助提取工藝條件進行優化，并對微波輔助提取的揮發油與一般水蒸氣蒸餾得到的揮發油進行抗氧化性能研究。結果表明，微波輔助提取揮發油的最佳工藝條件為微波功率330 W、提取時間25 min、液料比8.6 mL∶1 g，此條件下提取的纈草揮發油得率為（5.92±0.07）%。本試驗揮發油提取工藝穩定可行，提取率高，具有較強的還原能力，對DPPH自由基、羥自由基均有較強的清除能力，抗氧化能力與一般水蒸氣蒸餾法相比具有顯著差異。微波輔助提取是一種節能、高效、提取植物高品質揮發油的新技術，在植物開發及食品研究中具有很好的應用前景。

參考文獻：

［1］張 丹，周立新，林能明.纈草的藥理作用研究進展［J］.中國臨床藥學雜志，2014，23（6）：397－402.

［2］李 崗，范文壘，余德順，等.纈草揮發油的提取及抗氧化能力研究［J］.時珍國醫國藥，2015，26（11）：2647－2650.

［3］Golmakani T M，Rezaei K.Comparison of microwave－assisted hydrodistillation with the traditional hydrodistillation method in the extraction of essential oils from Thymus vulgaris L.［J］.Food Chem，2008，109（4）：925－930.

［4］Chemat F，Lucchesi M E，Smadja J，et al.Microwave accelerated steam diatillation of essential oil from lavender：a rapid，clean and environmentally friendly approach［J］.Anal Chim Acta，2006，555（1）：157－160.

［5］Wang ZM，Ding L，Li T C，et al.Improved solvent－freemicrowave extraction of essential oil from dried Cuminum cyminum L.and Zanthoxylum bungeanum Maxim［J］.J Chromatogr A，2006，1102（1／2）：11－17.

［6］Viana M A，Fernandez X，Visinoni F，et al.Microwave hydrodiffusion and gravity，a new technique or extraction of essential oils［J］.J Chromatogr A，2008，1190（1）：14－17.

［7］鄒小兵，陶進轉，夏之寧，等.微波輔助提取揮發油的研究進展［J］.中成藥，2010，32（6）：1014－1020.

［8］譚承佳，溫榮偉，馬家驊，等.微波提取柴胡揮發油的工藝研究［J］.中成藥，2014，36（6）：1315－1317.

［9］Kim D，Lee K W，Lee H J，et al.Vitamin C equivalent antioxidant capacity（VCEAC）of phenolic phytochemicals［J］.J Agric Food Chem，2002，50（13）：3713－3717.

［10］劉水英，李新生，黨 婭，等.響應面法優化紫山藥花青苷提取工藝及其抗氧化活性［J］.食品科學，2014，35（22）：84－91.

［11］陳美珍，余 杰，郭慧敏，等.大豆分離蛋白酶解物清除羥自由基作用的研究［J］.食品科學，2002，23（1）：43－47.

［12］殷 軍，葛 青，毛建衛，等.竹葉多糖的組分及抗氧化活性分析［J］.食品工業科技，2013，34（2）：100－103.