提取劑對蛹蟲草中蟲草素提取產率的影響

潘傳江，丁 杰，盛玉萍，王壽峰，劉 君

（四川理工學院分析測試中心，四川自貢643000）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛹蟲草，廣東金草行；蟲草素標準品，中國藥品生物制品鑒定所。

儀器：L－2000高效液相色譜儀，日立（中國）有限公司；RE52CS旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；WBFY－205微波反應器，鞏義市科瑞儀器有限公司；AS5150B超聲提取器，天津奧特塞恩斯儀器有限公司；標準檢驗篩，成都市企航儀器有限公司；索氏提取器，鄭州興化玻璃儀器廠。

試劑：石油醚、苯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、環己烷、乙酸乙酯均為成都科龍化工試劑廠生產的分析純試劑。乙腈、甲醇為色譜純，所用試驗用水均為去離子水。

1.2 蛹蟲草蟲草素的制備

取一定質量的蛹蟲草，粉碎，過篩，經石油醚脫脂，干燥處理后備用。準確稱量一定量的蛹蟲草粉置于50 mL錐形瓶中，加入適量的按一定比例配制的提取溶液，放入微波－超聲波儀中萃取，微波頻率2 450 MHz，超聲波頻率40 kHz，一定時間后將提取溶液置于旋轉蒸發儀濃縮至干，向錐形瓶中加入一定量的二氯甲烷，振蕩使其充分溶解，過濾，得到目標產物。將目標產物溶于50%甲醇溶液，定容后用于檢測分析［10］。

1.3 不同溶劑的考察

1.3.1 苯－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質量比）量的溶劑（苯 ∶無水乙醇＝9∶1）于錐形瓶微波－超聲提取50 min，趁熱抽濾，連續用5.0 mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉蒸發儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

1.3.2 甲苯－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質量比）量的溶劑（甲苯∶無水乙醇＝9∶1）于錐形瓶超聲提取50 min，趁熱抽濾，連續用5.0 mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉蒸發儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

1.3.3 環己烷－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質量比）量的溶劑（環己烷∶無水乙醇＝9∶1）于錐形瓶超聲提取50min，趁熱抽濾，連續用5 mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉蒸發儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0 mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

1.3.4 乙酸乙酯－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質量比）量的溶劑（乙酸乙酯 ∶無水乙醇 ＝9∶1）于錐形瓶超聲提取50min，趁熱抽濾，連續用5.0mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉蒸發儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0 mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

新建本科院校要改造圖書館的館風，進而改造學風，是一項系統工程，既要從圖書館自身因素入手，也要改變外部因素。

1.3.5 二氯甲烷－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質量比）量的溶劑（二氯甲烷 ∶無水乙醇 ＝9∶1）于錐形瓶超聲提取50 min，趁熱抽濾，連續用5.0 mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉蒸發儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0 mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

1.4 蛹蟲草蟲草素提取的正交試驗設計

選擇料液比（A）、提取溶劑比（B）、提取時間（C）、提取功率（D）4個因素，每個因素選取3個水平，考察4個因素對蛹蟲草中蟲草素提取率的影響，以蟲草素提取率作為考察指標，選用L9（34）正交試驗進行篩選最佳方法（表1）。

表1 提取蛹蟲草蟲草素的正交試驗因素及水平

1.5 蛹蟲草蟲草素的檢測

1.5.1 蟲草素標準溶液配制 準確稱量0.005 0 g蟲草素標準品，用50%甲醇溶液溶解，轉移至5.0 mL容量瓶中，定容，得到1.0 mg／mL的蟲草素標準儲備液。用移液槍移取不同量的標準儲備液分別稀釋成10、50、100、150、200μg／mL的標準溶液，搖勻，冷藏待用。

1.5.2 供試品溶液的制備 準確稱量一定量經脫脂后的蛹蟲草粉于一體化反應器中，按料液比 1 g∶4 mL，溶劑甲苯∶無水乙醇為10 mL∶1 mL，提取時間為50 min，提取功率為60W，置于微波－超聲波協同提取儀中，將儀器超聲波打開，在選定的微波功率下提取，一定時間后將提取液置于旋轉蒸發儀濃縮至干，加入一定量的二氯甲烷，振蕩使其充分溶解，過濾，得到目標產物。將目標產物溶于50%甲醇溶液，定容后用于檢測分析。

1.5.3 HPLC色譜條件 色譜柱為 ZORBAX Extend－C18柱（Analytical 4.6×250 nm 5－Micron 80 A），流動相為水 ∶甲醇 ＝95∶5，洗脫速率為 1.00 mL／min，柱溫 35℃，進樣量為10μL。

1.5.4 蟲草素標準曲線的繪制 按照“1.5.1”節配制標準儲備液，得到10、50、100、150、200μg／mL不同濃度的蟲草素標準溶液。按照“1.5.3”節色譜條件進樣，記錄色譜圖，測得峰面積S，以峰面積 S對濃度 C（mg／mL）作圖，得到回歸方程：y＝33 054x－41 890（r＝0.999），表明在 10～200μg／mL濃度范圍內線性關系良好。按信噪比3倍（S／N）計算，得到蟲草素的檢出限（LOD）為1μg／mL。

1.5.5 蛹蟲草中蟲草素含量計算

2 結果與分析

2.1 蟲草素HPLC檢測波長的確定

紫外分光光度法全波長掃描蟲草素標準品溶液，測定蟲草素的紫外吸收光譜，從圖1可以看出，蟲草素在259 nm處出現最大吸收，因此選擇HPLC的檢測波長為259 nm。

2.2 HPLC流動相的選擇

在試驗過程先后選用KH2PO4緩沖溶液加四氫呋喃、水－乙腈、水－甲醇作為流動相，比較各條件的分離效果，選擇最佳流動相。選用KH2PO4緩沖溶液加四氫呋喃作為流動相進樣測定時，經過幾次進樣試驗后，發現峰形逐漸變寬，經計算可知C18柱的柱效、理論塔板數都快速降低，要經過大量乙腈和甲醇沖洗活化后，才能使柱子勉強恢復到以前的效果。可見緩沖溶液對該柱子的損害作用很大，因此，KH2PO4緩沖溶液加四氫呋喃不宜作為流動相。當用水－乙腈作為流動相時，蟲草素標準品和腺苷標準品雖然出峰時間比較短，但峰形很差且分離效果不佳。當水∶乙腈＝1∶9時，腺苷和蟲草素的保留時間非常小且2個峰靠得很近，不能完全分開，彼此之間干擾較大，不適合用作分離的流動相。當增加或減少水的比例，2個標準品仍不能有效分離。而當用水和甲醇作為流動相時，蟲草素標準品和腺苷標準品的保留時間略有延長，分離效果較好，且峰形窄而對稱。用水∶甲醇體積比為9∶1作流動相保留時間出在可信度較高區域，但2個標準品的分離效果不是很好，當繼續增大水的比例時，2個峰的分離度越來越高；當比例達到19∶1時，雖然保留時間稍有增加，但峰完全分離開且峰形對稱尖銳、檢測靈敏度高（圖2）。當降低水的比例時蟲草素后面有明顯的拖尾，2個峰不能分離；而再加大水的比例雖然分離度稍好但保留時間延后很多，浪費時間、試劑，故選擇水∶甲醇體積比為19∶1作為流動相。

試驗結果表明，中性條件下分離效果較佳且色譜純有機溶劑用量少、操作簡便，且利于色譜柱的保護，使用壽命更長，有利于節約成本。色譜柱：ZORBAX Extend－C18柱（Analytical 4.6×250 nm 5－Micron 80 A）；柱溫為35℃；流速為1 mL／min；流動相為甲醇 ∶水（體積比）＝1∶19；每次進樣10μL；檢測器檢測波長259 nm。采用峰面積外標法定量。在此流動相條件下，對蛹蟲草子實體提取液進行測定，蟲草素與樣品中其他雜質能夠有效分開，無干擾，出峰時間適宜，分析穩定，分離效果見圖3。由于子實體中含有的腺苷和蟲草素的結構極其相似，在相同色譜條件下進樣腺苷標準品（圖4）。從圖2、圖3、圖4比較可見，腺苷和蟲草素的分離度相當大。

2.3 HPLC法繪制蟲草素標準曲線

按照以上色譜條件進樣測定“1.5.1”節所配標準溶液，記錄測定的蟲草素峰對應的面積S，以峰面積S對濃度C（μg／mL）作標準曲線（表2、圖5）。通過線性回歸得到回歸方程：y＝33 054x－41 890，線性相關系數為 r＝0.999，表明在10～200μg／mL濃度范圍內線性關系良好。按信噪比3倍（S／N）計算，得到蟲草素的檢出限（LOD）為1μg／mL。

表2 蟲草素標準曲線數據

2.4 蟲草素提取溶劑的選擇

以蟲草素提取率為指標，對蟲草素提取所用有機溶劑配比的選擇進行研究，粗提液定容到250.0mL，通過HPLC檢測，利用標準曲線求得蟲草素的含量，平行3次檢測求平均值（表3）。

從表3可以看出，相對于其他溶劑和無水乙醇配比而言，甲苯、苯與無水乙醇配比作為提取劑，蟲草素的溶出量較高；相較于單獨的無水乙醇或去離子水，蟲草素的溶出量也高出許多。這可能是由于在調節提取劑極性的同時在結構上也有相似的地方，蟲草素有一個類似于苯環的六元環，根據相似相容原理，增加了蟲草素的溶出；無水乙醇、水極性較大，對于本身極性較大的蟲草素也有較好溶出效果，但是相比甲苯和苯與無水乙醇配比作為提取劑時還是相差較大，而且當用水或無水乙醇做提取劑時，同時被溶出的雜質含量較高，不利于蟲草素更好地溶出；而其他幾種常見有機溶劑作為提取劑時對體系可能只起到調節極性或一些影響較小的作用，這些因素占了提取劑大量比例而不利于蟲草素的溶出。提取劑選用甲苯或苯與無水乙醇配比時蟲草素的溶出量相差不大，但在甲苯和苯之間，相較而言，苯的毒性更大，吸入人體后不能被排解，對人體傷害更大，且價格更昂貴，故選擇甲苯與無水乙醇配比作為提取劑。

表3 不同提取溶劑蟲草素提取率

2.5 蛹蟲草蟲草素的最佳提取條件正交試驗

超聲－微波協同提取蛹蟲草蟲草素的正交試驗各處理的蟲草素提取率結果見表4。4因素極差值R的大小依次為A＞C＞B＞D，即各因素對蟲草素提取率影響大小順序為料液比＞提取時間＞溶劑比＞微波功率。

通過k值確定其最優水平為A3B3C2D3，即料液比為1 g∶5 mL，溶劑比為19mL∶1mL，提取時間為50min，微波功率為60W。在該最優條件下試驗，其提取率為0.27%，提取率高于單因素結果，說明優化試驗條件后其提取率得到提高。重復進行5次試驗，其RSD為3.79%，重復性好，方案穩定可行。

3 結論

本試驗利用微波－超聲波法提取蛹蟲草中蟲草素，利用HPLC繪制蟲草素的標準曲線，通過線性回歸得到標準曲線方程為：y＝33 054x－41 890，r＝0.999，在10～200μg／mL濃度范圍內線性關系良好。LOD：1μg／mL。對比了一系列提取劑對蛹蟲草中蟲草素提取的影響，發現用甲苯和水作為提取劑時效果最好，甲苯和高純水的最佳配比為19 mL∶1 mL。通過正交試驗得到其最佳提取條件為料液比為1 g∶5 mL，溶劑比為19 mL∶1 mL，提取時間為50 min，微波功率為60 W，在該條件下蛹蟲草蟲草素的提取率為0.27%。不同因素對蟲草素提取貢獻的大小順序為料液比＞提取時間＞溶劑比＞微波功率。本試驗過程中，結合超聲波－微波協同處理蛹蟲草提取蟲草素，利用微波的高能作用和超聲波的空化作用有助于提高蟲草素的產量。

表4 超聲－微波協同提取蛹蟲草蟲草素正交試驗設計及結果

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