烏腺金絲桃內生真菌分離鑒定及其醇溶物的抑菌活性

范東海，趙麗麗，常桂英

（吉林農業科技學院，吉林吉林132101）

植物內生菌是指生活史的某一或全部時期生活于健康植物體內，而又不引起寄主植物明顯病害癥狀的細菌或真菌，它與植物在長期的進化過程中形成了互惠共生相互依存的關系［1］。

烏腺金絲桃（Hypericum attenuatum）別稱穩心草、趕山鞭，屬于植物界、被子植物門、木蘭綱、山茶目、藤黃科（Guttiferae）金絲桃屬（Hypericum）植物［2］，作為中草藥在民間廣為使用。高度0.3～0.7 m，有發達的側根和須根。莖豎直生長，植株上有許多黑色斑點分散生長，因而得名烏腺金絲桃。烏腺金絲桃葉片呈長卵形，花瓣五瓣、黃色，生長在植物頂端，果實深棕色、卵圓形，種子為細長的小圓柱形。一般在每年的7—8月間開花，在8—9月間結果。烏腺金絲桃大多分布在潮濕的小山丘、土坡、山腳路邊的草叢、草原、石礫地、林地及其周圍，廣泛生長于中國黑龍江、吉林、遼寧及內蒙古等地區。金絲桃屬植物的化學成分研究結果表明，該屬植物主要含有二蒽酮類、黃酮類、間苯三酚類和芳香酸類［3－4］化合物等化學成分，具有抗菌消炎、收斂止血以及治療黃疸、肝炎及瘡癤腫毒的作用，對心律失常、心肌缺血、心衰和增強免疫力等具有較好的功效，同時還具有抗抑郁、抗腫瘤及抗病毒等活性［5］。尤其是其中的黃酮成分對心律失常、心肌缺血、心衰、抑郁等心血管疾病具有很強的藥理活性。研究采用根段直接培養法［6］，將傳統形態分類與現代分子生物學技術相結合，對烏腺金絲桃根部真菌進行分離、鑒定，旨在為開展植物真菌研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

烏腺金絲桃全草（采自吉林農業科技學院烏腺金絲桃栽培基地）。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 乙醇（分析純），氯化汞（分析純），液氮，二甲苯（分析純），PDA配方：馬鈴薯200 g、水1 L、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，pH值自然。

1.2.2 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋（MLS－3751L－PC，松下健康醫療器械株式會社）；超凈工作臺（SW－CJ－ZFD，蘇州安泰空氣技術有限公司）；智能光照培養箱（PGX－350A，喬楓實業有限公司）；冰箱（BCD－221TMBA，青島海爾股份有限公司）；高速離心機（HC－2514，科大創新股份有限公司中佳分公司）；PCR擴增儀（THERM－1000，美國AXYGEN公司）；電泳儀（JY600，北京君意東方電泳設備有限公司）；凝膠成像儀（Image Quant LAS500，美國通用電氣）。

1.3 方法與準備

1.3.1 材料的預處理 取健壯的纖細根用自來水沖洗干凈，剪成1～2 cm段長。

1.3.2 消毒方法和時間選擇 75%乙醇消毒30 s→無菌水沖洗3～4次→無菌濾紙吸干→0.1%氯化汞消毒1 min→無菌水清洗3～4次→無菌濾紙吸干

1.3.3 菌株的分離與純化 將處理好的根段置于PDA培養基上，每皿接4段，10個重復，于25℃恒溫培養。待菌絲從根段的橫切面長出，并圍繞根段生長形成菌落后，挑取尖端菌絲接于培養基中，純化。純化后的菌株轉接在試管斜面培養基上，置于4℃冰箱內保存，備用。同時將最后1次無菌水沖洗液涂布于培養基中，于25℃恒溫培養，作為對照判斷表面消毒是否徹底。

1.3.4 內生真菌種屬鑒定 對分離得到的內生真菌進行顯微形態觀察，根據其菌絲體顏色、孢子形態、產孢結構及有無橫隔等特征，對其進行形態學鑒定［7－8］。除形態學鑒定外，通過分子生物學手段，通過擴增分析真菌rDNA的ITS序列，對其進行分子鑒定。

1.3.5 菌根真菌基因組DNA的提取 用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［9］提取真菌基因組DNA，在用酚－三氯甲烷提取前單獨用酚抽提1次，除去蛋白質。

1.3.5.1 PCR反應及產物檢測 選用的引物序列為：ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCG－3′；ITS4：5′－TCCTCCGCTTA TTGATATGC－3′。用于 ITS擴增的 PCR反應體系見表1。PCR反應參數為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火1 min，72℃后延伸10 min，45個循環；72℃延伸30 s。

表1 ITS擴增的PCR 50μL反應體系

1.3.5.2 鑒定 取 5μL PCR產物，用 1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，由北京華大基因研究中心進行測序。

1.3.5.3 系統發育樹的構建 將獲得的菌根真菌的ITS全序列與GenBank中的核酸數據庫進行同源性比對，選擇同源性較高的序列。使用ClustalX1.81軟件對篩選出的序列進行全序列多重比對，用MEGA5.1軟件計算遺傳距離，并以相應的種屬為外群進一步采用N－J法聚類構建系統發育樹。

1.3.6 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌效果 （1）烏腺金絲桃醇溶物的提取：采摘烏腺金絲桃全草，洗凈，將其干燥，80%乙醇浸提 12 h，收集醇溶液［10－12］，提取浸膏，干燥，用真空冷凍抽濾機干燥得結晶物，置于－40℃下儲存，備用。（2）供試菌液的制備：LB培養基的配制與滅菌→細菌的活化（37℃、24 h）→配制菌懸液備用。（3）濾紙片法抑菌效果測定：制備4種濃度分別為2、4、6、8 mg／mL的烏腺金絲桃醇溶物。采用濾紙片法，將直徑為10 mm的濾紙片滅菌后，分別浸泡于各濃度胞外粗提物溶液中2 h，分別吸取0.4 mL各供試菌懸液涂布于培養皿上，且以無菌生理鹽水組作對照。每個處理3個重復，置于37℃條件下培養24 h，測量各供試菌在不同濃度下的抑菌圈大小。

2 結果與分析

2.1 培養基觀察結果

從烏腺金絲桃根中分離出1株于PDA培養基上生長良好的優勢菌株，編號A85276。由圖1、圖2可知，菌落棉絮狀，菌絲緊密生長，正面中部呈淺黃色，邊緣呈白色；后期邊緣呈粉紅色，波浪狀。菌絲有隔，分枝，孢子呈圓柱形。

2.2 系統發育樹的構建

由所得的系統發育樹（圖3）可知，三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）與編號菌株A85276相似度很高，而且處于系統發育樹的同一分枝上，可證明所分離得到的菌株為三線鐮刀菌。

表2 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌效果

2.3 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌作用

由表2可見，烏腺金絲桃醇溶物的濃度越高，烏腺金絲桃醇溶物的抑菌圈直徑整體越大，說明胞外粗提物的濃度與抑菌效果呈正相關關系；同時，沙門氏菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑比較長，而四聯球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌的抑菌圈直徑與革蘭氏陰性菌相比較短。可能的原因是革蘭氏陽性菌能產生外毒素，在菌體開始生長的階段，代謝旺盛，細胞增殖快，外毒素含量高，對烏腺金絲桃醇溶物的活性破壞作用強，產生的抑菌效果不明顯；革蘭氏陰性菌能產生內毒素，在菌體生長階段，代謝旺盛，細胞增殖快，也有少量衰亡、死亡的細胞會釋放出內毒素，但含量低，對烏腺金絲桃醇溶物的活性破壞作用弱，產生的抑菌效果明顯。

3 結論與討論

采用根段直接培養法分離烏腺金絲桃內生真菌，在形態、分子鑒定的基礎上，將來自藥用植物烏腺金絲桃根部的1株內生真菌鑒定為三線鐮刀菌。其對烏腺金絲桃的生長產生的影響還需要進一步研究。抑菌試驗表明，烏腺金絲桃醇溶物對細菌有抑制作用，并與醇溶物濃度呈正相關，推測其醇溶物中可能含有抑制細菌生長的化學成分，未來可能在生物防治等方面提供作用。

綜上所述，菌根研究的不斷壯大，在一定程度上可豐富其他相關學科的內容，并促進其發展。特別是現代科學技術飛速發展的今天，基于學科之間的聯合、相互滲透的大趨勢，菌根研究對其他相關學科的進展將發揮越來越大的作用。

參考文獻：

［1］鄒文欣，譚仁祥.植物內生菌的研究新進展［J］.植物學報，2001，43（9）：881－892.

［2］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學出版社，2004.

［3］肖志勇.金絲桃屬植物化學成分研究進展［J］.中國野生植物資源，2004，23（1）：6－7.

［4］江紀武，肖慶祥.植物藥有效成分手冊［M］.北京：人民衛生出版社，1986.

［5］江蘇省植物研究所，中國醫學科學院藥物研究所.新華本草綱要（一冊）［M］.上海：上海科學技術出版社，1991：214－218.

［6］肖 軍，楊 濤，楊 鎮，等.藍莓菌根菌的分離與回接試驗［J］.遼寧農業科學，2012（5）：13－16.

［7］戴芳瀾.真菌的形態和分類［M］.北京：科學出版社，1987.

［8］劉應仙，孫會林.菌根的作用及菌根真菌的分離和鑒定［J］.中國林業，2011（4）：52.

［9］莊彩云，李潞濱，楊 凱，等.適用于rDNA ITS分析的蘭屬菌根真菌培養及DNA提取方法［J］.北京農學院學報，2007，22（3）：4－6.

［10］張 喜.烏腺金絲桃中金絲桃素的含量測定及提取純化金絲桃素的工藝研究［D］.長春：吉林大學，2011.

［11］王 玲，索朗斯珠，馬俊英.金絲桃素的提取分離及其藥理活性研究現狀［J］.動物醫學進展，2005，26（5）：32－35.

［12］邢桂珍.金絲桃素的提取與化學合成工藝的研究［D］.蘭州：中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研究生院，2007.