花粉管通道法介導辣椒總DNA獲得轉基因小麥

郭向萌，周曉君

（洛陽師范學院生命科學學院，河南洛陽471022）

花粉管通道法主要是利用有花植物授粉后形成的花粉管外通道，將外源DNA直接導入胚囊，對還處于融合期沒有形成細胞壁的受精卵細胞或者是早期的胚胎細胞進行轉化。20世紀70年代，花粉管通道法的創建者——我國著名育種專家周光宇先生在對當時多起遠緣雜交成功經驗進行總結后，提出了DNA片段雜交假說［1］。該假說認為，當外源DNA通過花粉管進入受體植物的胚囊后會被分解成片段。由于授粉后的胚囊內DNA活動活躍，所以殘留的外源DNA片段可能會被當作岡崎片段，從而整合到受體植物的DNA中。

由于花粉管通道法巧妙利用了有花植物的授粉過程，所以其操作簡單、技術成本低廉，在分子育種中具有較多優勢。主要優點有：（1）利用受體植物的生殖細胞進行外源DNA轉化，可以直接獲得轉化成功的植株，同時也可以直接獲得下一代含有外源DNA的種子，免去了進行細胞和原生質體的組織培養以及誘導再生植株的全套人工培養過程。如果在導入的外源DNA上加入特殊的分子標記，還可以直接對下一代進行多態性檢測。（2）可以利用該技術對所有開花植物進行各種外源DNA的轉化。由于不須要誘導再生植株，所以特別適用于某些難以誘導再生植株的作物，如小麥、豆類等。（3）受體植株中的生殖細胞在授粉期處于脫分化狀態，其細胞核變大、胞質變濃，分裂較為活躍，具備相當的轉化感受態和再生感受態，同時細胞壁還未形成，有利于各種形式的外源DNA進入；同時外源DNA的大小也不受限制，甚至可以將某些生物的總DNA全部導入。（4）全部操作比較簡單，不需要精密儀器設備，便于在野外或大棚中進行。（5）轉化效率高，一般可達1%左右。（6）由于利用了受體植物的生殖細胞，便于目標性狀得到穩定的遺傳，同時育種時間大大縮短，一般3～4代即可篩選出具有目的性狀并可穩定遺傳的品系［2－4］。

蘭考906是由河南省蘭考縣品種展示中心選育而成的優秀小麥品種［5］，屬半冬性中晚熟品種。本研究以蘭考906為基礎研究材料，嘗試通過遠緣雜交育種將辣椒的總DNA導入其中，從而提高小麥的維生素C和蛋白質含量，力求獲得產量高、品質佳的小麥新品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

洛椒9號、受體小麥T0代（蘭考906）由洛陽市農業科學研究所提供。本研究于2015年4月在洛陽市農業科學研究所試驗田對T0代小麥（蘭考906）進行辣椒總DNA導入，收獲種子播種后獲得變異體小麥T1代。

1.2 辣椒總DNA提取

當辣椒幼苗生長到3～4張真葉時，將其放在光線較暗處培養2 d左右，目的是減少葉片中的淀粉含量，將暗培養后的植株隨機采取足夠量的嫩葉，用CTAB法提取總DNA［6］。

1.3 辣椒總DNA質量檢測

取5μL辣椒總DNA試樣溶液，瓊脂糖凝膠電泳后進行結果觀測并拍照［7］。取10μL辣椒總 DNA樣品稀釋到500μL，采用 UV－2000分光光度計（美國尤尼柯）測定D260nm／D280nm，將質量符合要求的辣椒 DNA留存準備進行導入。

1.4 花粉管通道法導入辣椒總DNA

將所提辣椒總DNA用1×SSC溶液稀釋10倍配成導入液，在受體小麥（蘭考906）自花授粉一定時間后（約3 h左右），小麥花藥伸出，顏色變黃，將穎殼剪去約1／4，使花柱露出，然后開始導入。每株小麥柱頭上滴加20μL辣椒總DNA導入液，快速進行套袋保濕。

1.5 T1代種植與觀察

將T0代的種子與未經處理的小麥（蘭考906，共125粒作為對照組）進行播種，T0代共播種14行，蘭考906共播種5行，每行播種25粒，行間距約30 cm。當T1代出芽時，對其出芽率進行統計；當T1代材料受粉5 d左右時，觀察其表型性狀的變異情況，并記錄和統計主要變異類型。

2 結果與分析

2.1 辣椒總DNA質量檢測結果

本研究提取的辣椒DNA樣品，經過0.8%瓊脂糖凝膠電泳，呈現1條大小相同的DNA帶，沒有RNA污染。其D260nm／D280nm為1.71，說明得到的DNA質量較高、純度好，可以作為遺傳轉化的材料（圖1）。

2.2 T0代結實率

本研究對28株小麥（蘭考906）的500個小花進行辣椒總DNA導入，收獲347粒種子，結實率69.4%。

2.3 T1代出芽率

對T1代小麥出芽率進行觀察。經過花粉管通道法轉化的347粒種子共出芽194株，出芽率為55.9%。對照組小麥（蘭考906）共播種125粒，出芽120株，出芽率96%。

2.4 T1代變異觀察

對經過花粉管通道法轉化的T1代小麥形態進行觀察，發現經過辣椒總DNA轉化的小麥材料與對照組有較為明顯的差異。T1代材料的主要形態變化有畸形穗、畸形旗葉、穗無蠟質、莖上綠斑、黃條斑葉、植株變高、分蘗情況等（圖2）。

由表1可知，對照材料主要表現為畸形穗、畸形旗葉和不分蘗，穗無蠟質出現的概率也較高。同時，在變異材料中出現了較為少見的植株變高的情況，說明導入引起的表型變異類型較為豐富。材料總變異率為21.3%（部分植株畸形穗和畸形旗葉同時出現，部分不分蘗植株也同時出現了畸形穗和畸形旗葉的性狀；所以總變異率略低于各種表型變異率之和），對照材料總變異率為4.0%。

3 討論與結論

小麥分子育種有基因槍法、農桿菌介導法、低能離子束導入法等方法［8］。花粉管通道法導入辣椒總DNA是在植物整體水平進行的目的基因導入，帶有目的基因的DNA片段可能被整合進受體細胞基因中，也可能引起受體細胞基因在分子水平上發生其他改變，進而引起其表型性狀的變化［9］。

本試驗在T1代植株受粉5 d左右后觀察其表型性狀的變異類型及變異率，發現與對照組有較為明顯的差異。首先是出現了一些未在對照組中發現的變異類型，如穗無蠟質、莖上綠斑、黃條斑葉、植株變高、主次分蘗不同步以及育性降低（花藥發育異常）等；其次是T1代所有表型性狀變異的變異率均高于對照組，較為明顯的變異類型為畸形穗（變異率6.1%）、畸形旗葉（變異率7.6%）以及穗無蠟質（變異率4.1%），也有部分植株同時出現了多種變異類型。綜合來看，T1代材料總變異率為21.3%，遠高于對照組4.0%的變異率，表明利用花粉管通道法可以使受體細胞的基因以較高的概率發生多種分子水平的變異，進而引起較為豐富的表型變異，為篩選帶有目的性狀的新的小麥種質資源帶來很大的便利。后續研究將利用IRAP分子標記技術對T1代的遺傳多態性進行評估，對優良品種進行進一步的篩選和研究。

表1 T1代主要表型變異類型及變異率統計

參考文獻：

［1］周光宇.從生物化學的角度探討遠源雜交的理論［J］.中國農業科學，1978，11（2）：16－20.

［2］于 晶，任朝陽，閔 麗，等.花粉管通道法在單子葉作物遺傳轉化上的應用［J］.東北農業大學學報，2006，37（1）：130－134.

［3］簡純平，李開綿，歐文軍.花分管通道法轉基因育種研究進展［J］.熱帶作物學報，2012，33（5）：956－961.

［4］李 雪，安勝軍，邵鐵梅，等.芝麻花粉管介導胰島素基因的遺傳轉化［J］.江蘇農業學報，2016，32（5）：1013－1017.

［5］沈天民，劉文美，王德勝.優質超高產小麥新品系蘭考906及其栽培技術要點［J］.河南農業科學，2000，29（8）：38.

［6］俞文政，楊 貴，張映南，等.辣椒基因組DNA提取方法研究［J］.辣椒雜志，2007，5（4）：39－43.

［7］蘇 萍，吳 爽，李霞輝，等.電泳技術在鑒定玉米品種及純度中的應用［J］.黑龍江農業科學，2000（1）：36－37.

［8］李永春，王 瀟，陳 雷，等.中國小麥轉基因研究的現狀及前景［J］.中國農學通報，2008，24（5）：90－94.

［9］張 勇，劉朝輝，劉 成，等.外源種質導入引發小麥表觀遺傳變異的 MSAP分析［J］.科學通報，2007，52（24）：2857－2865.