埃茲蛋白通過L1細胞黏附分子信號通路促進肺癌轉(zhuǎn)移*

馮 輝，金明根，金鐵峰

(1.延邊大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，吉林延吉 133000；2.延邊大學腫瘤研究中心，吉林延吉 133002)

在我國，肺癌的發(fā)病率及病死率居于各類惡性腫瘤的首位[1-2]。本課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn)，埃茲蛋白(Ezrin)在非小細胞肺癌組織中明顯高表達，且與腫瘤的惡性程度及不良預后呈正相關[3-5]。L1細胞黏附分子(L1-cell adhesion molecule,L1CAM)可以使細胞間黏附性喪失，現(xiàn)已證實其與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關[6-8]。最新的研究證實Ezrin可與L1CAM緊密結合行使重要功能[9]，但其具體機制不詳。本研究旨在探討Ezrin通過調(diào)控L1CAM的表達促進肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的機制，為臨床診治肺癌提供新的理論基礎，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 肺癌細胞系人肺大細胞癌細胞H460、人肺鱗癌細胞EBC-1、人肺腺癌細胞A549、人肺腺癌細胞PC9、人肺腺癌細胞H1299、人肺巨細胞癌細胞95D等(美國ATCC公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Santa Cruz 公司)；鼠抗人Ezrin及L1CAM抗體(美國Abcam公司)；電化學發(fā)光(ECL)試劑盒(美國Pierce公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 試驗選取肺癌細胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D等細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，3 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.2.2RT-PCR檢測肺癌細胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D 細胞Ezrin的表達 用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，以Triozol充分裂解細胞后，加入氯仿震蕩，加入異丙醇靜置，反應溫度為95 ℃變性，58 ℃退火，72 ℃延伸。行凝膠電泳，最終置于凝膠成像儀分析結果，分析各細胞系Ezrin的表達水平。Ezrin引物序列：上游5′-TGGAGTTGATGCCCTTGGAC-3′;下游 5′-AGTCAGGTGCCTTCTTGTC-3′。

1.2.3Westem blot檢測 通過Western blot 檢測肺癌細胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D 細胞Ezrin蛋白的表達，將上述細胞系以冷PBS洗2次后提取總蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白濃度，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳垂直電泳進行蛋白分離，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下?lián)u床封閉[Tris緩沖生理鹽水吐溫(TBST)+5%脫脂奶粉]2 h，加入一抗，4 ℃過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶二抗，孵育2 h。ECL曝光，觀察并拍照。試驗重復3次。

1.2.4應用siRNA沉默高轉(zhuǎn)移肺癌95D細胞系Ezrin的表達 應用Ezrin小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA，由廣州銳博公司構建)沉默肺癌高轉(zhuǎn)移細胞系95D的Ezrin的表達。Ezrin siRNA-1正義鏈：5′-AAGGAAUCCUUAGCGAUGAGAdTdT-3′,反義鏈：3′-dTdTUUCCUUAGGAAUCGCUACUCU-5′。Ezrin siRNA-2正義鏈：5′-GGAAUCCUUAGCGAUGAGAdTdT-3′,反義鏈：3′-dTdTCCUUAGGAAUCGCUACUCU-5′。選取Ezrin沉默效率更高的Ezrin siRNA-1進行后續(xù)試驗。通過Western blot檢測沉默有效性。

1.2.5劃痕試驗 應用劃痕實驗對比肺癌高轉(zhuǎn)移細胞系95D細胞和Ezrin沉默后95D細胞(siEzrin-95D)的遷移能力 將5×105個細胞(95D細胞和siEzrin-95D細胞)接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細胞融合度達到80%，用移液槍槍頭在單層細胞上劃一條直線，用PBS清洗3次。培養(yǎng)48 h后觀察周邊細胞生長程度并拍照，進行比較分析。

1.2.6L1CAM蛋白表達檢測 檢測Ezrin基因沉默前后高轉(zhuǎn)移肺癌細胞95D和低轉(zhuǎn)移肺癌細胞H460的L1CAM蛋白表達。同樣應用小干擾RNA沉默95D和 H460細胞的Ezrin的表達，進一步通過Western blot檢測95D、siEzrin-95D、H460、siEzrin-H460細胞的L1CAM蛋白表達情況。

2 結 果

2.1Ezrin促進肺癌細胞遷移 RT-PCR及Western blot結果顯示在高轉(zhuǎn)移肺癌細胞系95D及PC9中Ezrin 表達均明顯高于低轉(zhuǎn)移肺癌細胞系H460及EBC-1(圖1)。應用siRNA沉默95D細胞Ezrin基因表達，通過Western blot驗證Ezrin基因沉默有效性(圖2A)后，進一步通過細胞劃痕試驗發(fā)現(xiàn)，與95D細胞相比,siEzrin-95D細胞的遷移能力明顯減弱(P<0.05)，見圖2B、C。

A:RT-PCR檢測各組細胞系中Ezrin的表達；B：Western blot檢測各組細胞系中Ezrin的表達。

圖1細胞系中Ezrin的表達

A:Western blot檢測95D細胞及siEzrin-95D細胞中Ezrin的表達；B：劃痕試驗 95D細胞及siEzrin-95D細胞經(jīng)處理48 h后細胞遷移情況；C：劃痕試驗結果定量分析

圖2 Ezrin沉默對95D細胞遷移能力的影響

A．Western blot檢測Ezrin基因沉默前后95D細胞和H460細胞L1CAM的表達；B.L1CAM蛋白的定量分析

圖3 siRNA沉默95D細胞和H460細胞Ezrin

后細胞中L1CAM蛋白比較

2.2Ezrin 通過L1CAM信號通路調(diào)控肺癌細胞的遷移能力 前面試驗已經(jīng)證實，沉默95D細胞Ezrin表達后，其細胞遷移能力明顯下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)siRNA沉默95D及H460細胞Ezrin表達后，與95D及H460細胞比較，siEzrin-95D及siEzrin-H460細胞中L1CAM的表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin在肺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，在有淋巴及遠隔轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌中陽性表達率顯著高于無淋巴轉(zhuǎn)移者，且與肺癌遠處轉(zhuǎn)移呈正相關[10]。Ezrin可以通過EGFR信號通路調(diào)控非小細胞肺癌的演進[11]。L1CAM在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[12-13]。通過生物信息學網(wǎng)站檢索發(fā)現(xiàn)Ezrin與L1CAM具有密切的相關性，提示Ezrin基因可能通過調(diào)控L1CAM的表達而促進肺癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，但其具體調(diào)控機制目前鮮見報道，還有待于深入研究。KUDUMALA等[9]的研究證實Ezrin可以特異地與L1CAM結合，在黑腹果蠅的神經(jīng)傳導過程中起重要作用。AIKAWA[14]研究表明，L1CAM在靠近細胞膜表面的部位存在Ezrin泛素化結合域，并對其基因表達、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞等一系列生命活動起到重要影響。KIEFEL等[15]在肺癌細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，Ezrin結合到L1CAM蛋白后可以介導并活化核因子kappa B(NF-κB)信號通路，從而促進表皮間質(zhì)化(MET)的發(fā)生。

本研究結果顯示，Ezrin在高轉(zhuǎn)移能力肺癌細胞系中的表達顯著高于低轉(zhuǎn)移能力的肺癌細胞系。通過siRNA沉默抑制肺癌細胞Ezrin的表達后肺癌細胞遷移能力明顯下調(diào)，且Ezrin表達水平下調(diào)后L1CAM的表達顯著受到抑制。這提示，Ezrin的表達與肺癌細胞的遷移能力具有密切相關性，其機制可能是通過調(diào)控L1CAM信號通路而實現(xiàn)的。Ezrin及L1CAM分子有可能成為控制肺癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要靶點，該研究結果為臨床診治肺癌，尤其是預防肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移提供了重要的研究線索。

參考文獻

[1]CUI G,LIU D,LI W,et al.A meta-analysis of the association between BRAF mutation and nonsmall cell lung cancer[J].Medicine,2017,96(14):e6552.

[2]SONG Z,WANG X,ZHENG Y,et al.MET gene amplification and overexpression in chinese non-small-cell lung cancer patients without EGFR mutations[J].Clin Lung Cancer,2017,18(2):213-219.

[3]JIN T,JIN J,LI X,et al.Prognostic implications of ezrin and phosphorylated ezrin expression in non-small cell lung cancer[J].BMC Cancer,2014，14(1):191.

[4]JIN J,JIN T,QUAN M,et al.Ezrin overexpression predicts the poor prognosis of gastric adenocarcinoma[J].Diagn Pathol,2012，7(1):135.

[5]LIN L J,CHEN L T.Association between ezrin protein expression and the prognosis of colorectal adenocarcinoma[J].Mol Med Rep,2013,8(1):61-66.

[6]VALIENTE M,OBENAUF A C,JIN X,et al.Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis[J].Cell,2014,156(5):1002-1016.

[7]GONZ LEZ-DOM NGUEZ R,GARC A-BARRERA T,GMEZ-ARIZA J L.Using direct infusion mass spectrometry for serum metabolomics in Alzheimer′s disease[J].Anal Bioanal Chem,2014,406(28):7137-7148.

[8]LAX S F,TAMUSSINO K F,LANG P F.Metastatic mechanisms of uterine malignancies and therapeutic consequences[J].Pathologe,2016,37(6):549-556.

[9]KUDUMALA S,FREUND J,HORTSCH M,et al.Differential effects of human L1CAM mutations on complementing guidance and synaptic defects in Drosophila melanogaster[J].PLoS One,2013,8(10):e76974.

[10]陳清勇,嚴杰,胡慧珍,等.埃茲蛋白的表達與非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移和預后的關系[J].中華腫瘤雜志,2012,34(6):436-440．

[11]VICTORIA H,ALVIN S,ABDI G I,et al.Ezrin regulates focal adhesion and invadopodia dynamics by altering calpain activity to promote breast cancer cell invasion[J].Mol Biol Cell,2015,26(19):3464-3479.

[12]TRIETSCH M D,OONK M H,HAWINKELS L J,et al.Prognostic value and clinicopathologic characteristics of L1 cell adhesion molecule (L1CAM) in a large series of vulvar squamous cell carcinomas[J].Oncotarget,2016,7(18):26192-26205.

[13]楊少芬,池秀芳.肝癌患者高表達神經(jīng)細胞黏附分子L1預后差[J].重慶醫(yī)學,2015,44(22):3055-3057.

[14]AIKAWA Y.Ubiquitination within the membrane-proximal ezrin-radixin-moesin (ERM)-binding region of the L1 cell adhesion molecule[J].Commun Integr Biol,2013,6(4):e24750.

[15]KIEFEL H,BONDONG S,PFEIFER M,et al.EMT-associated up-regulation of L1CAM provides insights into L1CAM-mediated integrin signalling and NF-κB activation[J].Carcinogenesis，2012,33(10):1919-1929.