一株對氯酚降解菌的篩選及降解特性

鄭曉寧

（無棣縣環境監測站，山東 無棣 251900）

氯取代酚屬典型的難降解有機物，也是潛在的內分泌干擾物，其中的很多化合物被認為具有致癌、致畸、致突變和遺傳毒性，美國環境保護局（USEPA）和我國都將氯取代酚列為優先控制有毒污染物[1]。但氯酚作為一類非常重要的工業有機化合物，被廣泛應用于染料、防腐劑、除草劑、殺蟲劑和殺菌劑等化合物的生產中，全球每年的氯酚生產量約為2×105t[2]。氯取代酚的大量生產與排放導致水質和土壤的嚴重污染[3]。由于該類化合物的芳香環結構以及氯取代基使得氯酚類化合物具有很強的抗降解能力，傳統的物化和生化方法難以對該類化合物進行有效處理[4]。在實際廢水中，氯取代酚經常與其他污染物質共同存在，其他有毒化合物的存在會抑制微生物的活性，增加氯取代酚的生物降解難度[5-6]。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

基礎鹽培養基：（NH4）2SO41.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， 水1 L，pH 7.0～7.2。菌株降解試驗時，所用基礎鹽培養基中添加終濃度為1%的葡萄糖。

LB培養基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 L，pH7.0～7.2。固體培養基在其中加入2%的瓊脂粉。所有培養基使用前均在121℃下濕熱滅菌20 min。

酵母粉、蛋白胨、瓊脂等購自北京奧博星生物技術有限公司；液相色譜用甲醇為色譜純，購自上海星可生化有限公司；對氯酚標樣為色譜純，購自安徽合肥融宇生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 菌株的分離與純化

將采自山東無棣的某制革廢水用無菌水梯度稀釋，涂布LB平板，挑取長出的菌落在LB液體培養基中擴大培養，將培養液轉接到含有50 mg/L對氯酚的基礎鹽培養基中，于30℃、150 r/min的搖床上培養2 d，測定培養基中的對氯酚濃度，用紫外掃描儀通過波長掃描驗證菌株降解對氯酚的效果。將有降解效果的菌株通過平板劃線方法純化后開展相關試驗。

1.3 對氯酚的分析測定

菌株篩選過程中對氯酚降解能力的測定采用紫外掃描法：紫外掃描儀型號為UV-2300（上海天美科學儀器有限公司）；取1 mL培養液到1.5 mL離心管，于12000 r/min離心1 min，取上清液0.5 mL加基礎鹽培養基至終體積3 mL，于200～300 nm波長處連續掃描測定，特征吸收峰為281 nm。根據接菌與不接菌的樣品間的差異，確定菌株的降解效果。

降解試驗過程中對氯酚的測定采用液相色譜法：高效液相色譜儀為Waters Alliannce-2695型，配Waters SunFire C18 （4.6 nm×250 mm）色譜柱。流動相為甲醇:水（7:3，v:v），流速為0.7 mL/min，檢測波長為200～300 nm，對氯酚的定量波長為281 nm，進樣量20 μL，采用外標法按峰面積定量。其他化合物的定量波長統一采用260 nm，其他條件同對氯酚濃度的測定。

對氯酚降解率的計算公式為：

式中，Ct是接菌樣品中的對氯酚終濃度；Cc是指對照（相同培養條件但未接入降解菌）樣品中的對氯酚濃度；Y是指對氯酚的降解率。

對氯酚降解速率的計算公式為：

式中，Ct是接菌樣品中的對氯酚終濃度；Cc是對氯酚初始濃度；t為Cc和Ct取樣時間；Y為菌株降解對氯酚的平均速率。

1.4 菌株降解對氯酚試驗

降解試驗所用的菌懸液是指在LB培養基中培養至對數期后期（種子液OD600約為5.0）的培養液，所有實驗均在250 mL錐形瓶中進行，若無特殊說明，對氯酚的初始濃度為100 mg/L，接種量為2%（v：v）。接種后，樣品放于30℃、150 r/min的搖床上振蕩培養，定時取樣測定其中的對氯酚濃度。

2 結果與討論

2.1 降解曲線試驗

在100 mL的基礎鹽培養基中加入對氯酚，使對氯酚的終濃度為100 mg/L。在培養基中接入2 mL的菌懸液，放置于30℃、150 r/min搖床上振蕩培養，定時取樣。上述試驗以不接任何菌株的樣品為對照，結果如圖1所示。試驗結果表明，與未接入ZQ-1的對照組相比，加入ZQ-1可使培養液中的對氯酚濃度明顯降低，48 h后幾乎全部降解，說明菌株ZQ-1能夠降解對氯酚；但在此過程中培養液的OD600沒有明顯變化，說明菌株不能以對氯酚進行生長。另外，接入ZQ-1，培養基的顏色變為褐色，隨著培養時間的延長，褐色會加深。而對照和空白（接入ZQ-1但不加對氯酚）樣品則沒有這種顏色產生，這可能是菌株ZQ-1降解對氯酚的過程中產生了一種新物質，從而導致顏色變化。

圖1 菌株ZQ-1降解對氯酚的曲線

2.2 環境條件對菌株降解對氯酚的影響

2.2.1 pH對菌株降解對氯酚的影響

pH值可以影響酶的活性、菌體對營養物質的吸收及菌體細胞的結構，從而影響菌體的生長和反應活性。用NaOH和HCl調節無機鹽培養基的pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，滅菌后加入對氯酚，使對氯酚的終濃度為100 mg/L。接入菌株ZQ-1，置于30℃、150～170 r/min搖床振蕩培養，在培養48 h時取樣，測定對氯酚濃度。結果表明，菌株ZQ-1在pH＝6.0～8.0時能較好地降解對氯酚。

2.2.2 溫度對菌株降解對氯酚的影響

將菌株ZQ-1接種于含對氯酚的無機鹽培養基中，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下恒溫培養，對氯酚的初始濃度為100 mg/L，24 h后取樣測定培養液中的對氯酚濃度。結果表明，35℃時該菌株降解對氯酚的效率最高，可統一達到70%。

2.3 對氯酚的初始濃度對菌株降解對氯酚的影響

在基礎鹽培養基中加入對氯酚，使對氯酚的終濃度分別為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L和400 mg/L，按2%的接種量向其中接入降解菌株的菌懸液。12 h、24 h、36 h和48 h取樣測定培養培養液中的對氯酚濃度。結果表明，對氯酚初始濃度為200 mg/L時，菌株降解對氯酚的速率最快。

2.4 菌株的降解譜試驗

在基礎鹽培養基中分別添加苯酚、對氯酚、對甲酚、鄰甲酚、1-萘酚、吡啶、間甲酚、2,4-二氯酚、3,5-二硝基酚、吩噻嗪、3,5-二硝基水楊酸和對硝基酚。接入菌株ZQ-1，結果表明，該菌對苯酚和對氯酚有較好的降解效果，對其他芳香族化合物無明顯降解效果。

3 結論

從制革廢水中分離到1株降解對氯酚的棒狀菌屬細菌ZQ-1。該菌株降解對氯酚的最適pH值為6.0～8.0，最適溫度為35～40℃，對氯酚的初始濃度與菌株降解速率呈負相關，對對氯酚和苯酚具有較強的降解能力。

參考文獻

1 YOUNES M.Specific issues in health risk assessment of endocrine disrupting chemicals and international activitie[J].Chemosphere，1999，39（8）：1253-1257.

2 姜 梅，牛世全，展惠英，等.氯酚類化合物的微生物降解研究進展[J].應用生態學報，2003，14（6）：1003-1006.

3 郜瑞瑩，王建龍.pH對厭氧顆粒污泥吸附4-氯酚的影響[J].環境科學，2007，28（4）：791-794.

4 Peru-Titus M，Garcia-Molina V，Banos M A，etal.Degradation of chlorophenols by means of advanced oxidation processed[J].Applied Catalysis B Environmental，2004，47（4）：219-256.

5 全向春，施漢昌，王建龍，等.苯酚存在對生物強化系統降解2,4-二氯酚的影響[J].環境科學，2003，24（1）：75-79.

6 陳 皓，陳 玲，黃愛群，等.重金屬對2-氯酚厭氧降解的抑制動力學研究[J].中國環境科學，2010，30（3）：328-332.