長江流域10個不同水域克氏原螯蝦野生群體形態差異分析

張 龍，石林林，梁宏偉，李青彬，李艷和

(1.華中農業大學水產學院，農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，水產養殖國家級實驗教學示范中心，武漢 430070；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢430223)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗名小龍蝦，隸屬十足目(Decapoda)螯蝦亞目(Astacidea)蝲蛄科(Cambaridae)原螯蝦屬(Procambarus)[1]，因其蝦肉營養價值高，味道鮮美，氨基酸種類多，蛋白質含量高及脂肪含量低[2]，受到了眾多消費者的喜愛[3]。克氏原螯蝦對環境適應性強，耐低氧、病害少，能夠生長在湖泊、溝渠、沼澤和稻田等其它水域。因此，無論是在我國南方還是北方，克氏原螯蝦均可以生存[4，5]。克氏原螯蝦在近幾十年的繁衍和遷徙之中，受到當地氣候、水環境及其他因素的影響可能已經在一些形態上產生了差異。對克氏原螯蝦形態特征的研究能夠快速、經濟、直觀地反映不同群體的形態差異，但這種方法一般適用于種間的系統分類，對種內不同群體不能有效鑒別，采用多元統計分析能夠有效克服這個缺點[6]。多元回歸分析常用于研究自變量與因變量之間潛在的本質關系，現已廣泛應用于許多水生動物形態特征與其體重關系、群體分布以及雌雄鑒別模型等研究中[7]。本研究對來自長江上游、長江中游、長江下游以及靠近長江下游的洪澤湖和高郵湖的10個克氏原螯蝦野生群體的形態運用3種多元統計方法以及T檢驗進行差異分析。通過對這些差異的分析，以期為克氏原螯蝦的群體鑒別、種質資源以及繁殖育種等研究提供基礎生物學資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于本研究的野生克氏原螯蝦來自于長江流域的10個不同自然水體，樣品于2016年4-8月采集，樣本采集信息見表1。

表1 采樣信息表Tab.1 Sampling information

1.2 形態參數測量與數據處理

參照王克行[8]的測量方法，用游標卡尺測量每尾蝦的全長、頭胸甲長、頭胸甲寬、第一腹節長、第一腹節寬和腹節總長(圖1)，精確到0.1 mm；用天平稱取體質量，精確到0.01 g。數據分析采用SPSS 22.0軟件包處理，運用聚類分析、主成分分析、判別分析和T檢驗對所得實驗數據進行分析。為消除蝦體大小對參數值的影響，多元分析中采用以全長為基數或取兩個形態參數的比值。本研究共選取了13項形態比例參數，具體見表2。

圖1 克氏原螯蝦各形態測量指標Fig.1 The morphological measurement indexes of P.clarkiia.全長；b.頭胸甲長；c.腹節總長；d.頭胸甲寬；e.第一腹節長；f.第一腹節寬

表2 13項克氏原螯蝦形態特征比例參數Tab.2 13 Morphological characteristics of P.clarkii

注：a.全長；b.頭胸甲長；c.腹節總長；d.頭胸甲寬；e.第一腹節長；f.第一腹節寬；W.體重

1.3 分析方法

1.3.1 聚類分析

首先運用EXCEL分別求出各個群體13項形態指標的平均值，然后采用歐式系統聚類法對這些平均值進行聚類分析。

1.3.2 主成分分析

主成分分析是一種將多個指標做小數指標的統計方法。先對數據進行校正處理，然后用SPSS 22.0軟件對10個不同水域克氏原螯蝦野生群體的形態參數進行主成分分析，得出各個成分的特征值、貢獻率以及主成分載荷值。

1.3.3 判別分析

運用逐步判別分析法進行分析，對判別貢獻率較大的指標建立判別方程，判別準確率的計算參照李思發等[9]的方法，計算公式如下：

判別準確率=某克氏原螯蝦群體判別正確的尾數/該群體的實際尾數×100%

式中：Ai為第i個群體中判別正確的尾數，Bi為第i個群體的實際尾數，k為群體數。

1.3.4 差異系數(CV)檢驗

按如下參考公式進行：

CV=(M1-M2)/(S1+S2)

式中：M1和M2表示2個群體某指標的平均值，S1和S2為標準差。若CV值小于1.28，則表示2個群體在這項指標上的差異未達到亞種水平。

1.3.5 T檢驗

將10個群體的克氏原螯蝦分成雌雄兩組，然后對兩組克氏原螯蝦的13項形態指標進行T檢驗，判斷雌雄在某性狀指標的差異程度，若P>0.05則表示差異不顯著，反之則視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 聚類分析

對10個不同自然水域野生克氏原螯蝦的13項形態指標平均值的聚類分析結果顯示雌雄克氏原螯蝦均分為2類(圖2，圖3)，均為重慶忠縣、湖北洪湖、江西湖口、湖北荊州聚為一類，其它群體聚為一類。在雌性群體中，江蘇高郵和江蘇洪澤歐式距離最短，首先聚為一支，后再與上海崇明、江蘇南京、四川宜賓和江蘇無錫聚為一支；雄性群體中，同樣也是江蘇高郵和江蘇洪澤首先聚為一支，再同江蘇南京、四川宜賓、上海崇明和江蘇無錫聚為一支。

圖2 10個不同水域克氏原螯蝦雌性群體聚類分析Fig.2 Cluster analysis of P.clarkii female populations from 10 different watersheds

圖3 10個不同水域克氏原螯蝦雄性群體聚類分析Fig.3 Cluster analysis of P.clarkii male populations from 10 different watersheds

2.2 主成分分析

對10個不同水域克氏原螯蝦野生群體進行主成分分析，選取了前四個主成分用于分析，累積貢獻率為84.003%。其中主成分1為28.393%、主成分2為23.968%、主成分3為18.981%、主成分4為12.661%，較好地反映了克氏原螯蝦群體的形態特征。第一主成分的特征根為3.691，方差貢獻率為28.393%，反映了克氏原螯蝦腹節總長的長度特征，稱為腹長因子；第二主成分的特征根為3.116，方差貢獻率為23.968%，反映了克氏原螯蝦第一腹節的長度特征；第三主成分主要反映的是腹節寬度的特征，稱為腹寬因子；第四主成分主要反映了克氏原螯蝦頭胸甲的特征，稱為頭胸甲因子。在10個群體中，江蘇高郵群體第一主成分貢獻率最高(39.776%)，最低為上海崇明群體(30.127%)；4個主成分累積貢獻率最高的是重慶忠縣群體(91.736%)，最低的是上海崇明群體(84.997%)(表3)。

表3 10個不同水域克氏原螯蝦群體的特征值和累積貢獻率Tab.3 Eigen values and cumulative contribution rates of P.clarkii from 10 different watersheds

2.3 判別分析

通過逐步判別分析方法，從13項性狀比值中篩選出對于區分10個不同水域克氏原螯蝦雌性群體有顯著貢獻的5個變量X1、X2、X4、X7和X11。當雌性群體判別函數有這5個變量時，顯著性檢驗結果Wilks’λ=0.102，P<0.000 1，說明利用這5個變量建立的雌性群體判別函數的判別效果良好，具有極顯著的意義。對于雄性群體則篩選出了4個變量X1、X4、X9和X11，當雄性群體判別函數有這4個變量時，顯著性檢驗結果Wilks’λ=0.114，P<0.000 1，說明利用這4個變量建立的雄性群體判別效果良好，具有極顯著的意義。利用建立的判別方程式(略)對10個不同水域克氏原螯蝦雌雄群體進行判別。將每尾雌性個體的5項性狀的數值和每尾雄性個體的4項性狀的數值分別帶入雌雄群體的判別方程，函數值最大的判別方程所對應的群體就是該個體的所屬群體。雌性群體中，判別率最高的是南京群體(93.1%)，最低的是洪澤群體(32.1%)，綜合判別率為64.7%；雄性群體中，判別率最高的是宜賓群體(100%)，最低的是高郵群體(7.1%)，綜合判別率為65.6%(表4)。

表4 克氏原螯蝦雌雄群體的判別結果Tab.4 Discrimination results for male and female P.clarkii populations %

續表4

2.4 T檢驗

運用T檢驗對所采集的雌雄克氏原螯蝦(雌性272尾，雄性192尾)的13項形態參數進行分析，結果表明雌雄克氏原螯蝦在X1、X2和X9這3個形態參數上有顯著性差異(P<0.05)，在X3、X4和X13這3個形態參數上的差異達到了極顯著(P<0.01)(表5)。從雌雄各形態參數的平均值看，6個有顯著性差異的參數中，雄性X1、X2、X3和X9的平均值比雌性的大；而雌性的X4和X13這兩個形態的平均值比雄性大。因此雌雄之間的形態學差異主要在體重、頭胸甲長、頭胸甲寬、第一腹節長和腹節總長上，且雄性體重、頭胸甲長和頭胸甲寬的平均值比雌性大，雌性的腹節總長平均值比雄性的大。

表5 雌雄兩組群體的13項形態特征比例參數統計表Tab.5 Differences in the proportional parameters of 13 morphological characteristics between male and male group

注：*表示P<0.050，存在顯著性差異。

2.5 差異系數(CV)檢驗分析

差異系數檢驗的結果(表6)顯示，在13項形態指標中，有6項指標的差異系數值大于臨界值1.28，但尚未占到13項指標的絕大多數。所以，10個群體克氏原螯蝦群體間形態差異并未達到亞種以上分類水平。

3 討論

3.1 克氏原螯蝦不同群體間的形態差異分析

聚類分析可對不同群體進行初步分類，聚類的距離可以反映不同群體親緣關系的遠近[10]。本研究聚類分析結果顯示10個不同水域克氏原螯蝦的雌雄群體均為江蘇高郵與江蘇洪澤最先聚為一支，說明這兩個群體的親緣關系最近；重慶忠縣、江西湖口、湖北荊州和湖北洪湖的雌雄群體與其它群體最后才聚為一支，表明這幾個位于長江中上游地區的克氏原螯蝦群體與江蘇南京、江蘇無錫和上海崇明等處于長江下游地區的克氏原螯蝦群體親緣關系較遠。韓曉磊等[10]對不同地區克氏原螯蝦形態差異分析表明江蘇群體與湖北群體形態差異較遠；鄭友等[11]對6個水域克氏原螯蝦形態差異分析結果顯示鄱陽湖群體與洪澤湖群體親緣關系較遠，2個群體存在顯著差異，其聚類分析結果均與本研究結果一致。值得注意的是，本次聚類分析顯示四川宜賓的雌雄群體均與江蘇無錫、上海崇明等長江下游水域聚為一類，這個結果與地理分布不相符合。克氏原螯蝦已成為我國重要的水產養殖對象，長江中下游地區是克氏原螯蝦人工養殖的主產區，苗種及成蝦可能會因為銷售等因素而存在于地理上較遠的水域[12]。宜賓市河流多、密度大、水量豐富，共有大小溪流600多條，但因其河流多源于崇山峻嶺，故水流湍急，加之長江所建水電站較多，因此，筆者推測克氏原螯蝦雖遷徙能力較強，但也難以從長江末段的無錫、上海等水域遷徙到宜賓。并且近年來隨著克氏原螯蝦市場的火爆，克氏原螯蝦養殖面積不斷擴大，這讓長江中下游地區的苗種和成蝦通過銷售等其它非自然因素方式進入宜賓成為可能。此外，宜賓市的河流縱橫交錯形成網狀，易于克氏原螯蝦在宜賓各河流分支的擴散。

表6 克氏原螯蝦群體間差異系數Tab.6 The coefficient of variation among P.clarkii populations

注：差異系數是指差別最大的2個群體間的CV值。

主成分分析能夠將多個變量通過線性變換成幾個少數主成分變量，并且要求這幾種主要變量的相關性要盡可能低，是一種將少數主要變量來代替原來多變量的方法[13]。該方法現已經廣泛應用于水產動物的形態分析，并取得了良好的效果[14]。韓曉磊等[15]對克氏原螯蝦和東北螯蝦的形態學特征進行主成分分析，結果表明第一主成分反映了克氏原螯蝦和東北螯蝦身體寬度的形態變化；安麗等[16]對67尾翹嘴紅鲌的10項比例性狀進行主成分分析后，將翹嘴紅鲌的形態指標歸納為“肥瘦特征”、“軀干特征”、“眼間距特征”、“尾部特征”和“頭部特征”，較為完整地描述了翹嘴紅鲌的形態特征；梁宏偉等[17]利用主成分分析獲得了長豐鰱和長江鰱15個指標85%以上的信息，較好地反映了長豐鰱和長江鰱的形態性狀信息。本研究將13項性狀比值簡化為4個主成分綜合指標，累積貢獻率達84.003%，較好地反映了克氏原螯蝦的形態信息。其中前兩個主成分的累積貢獻率為52.361%，反映了克氏原螯蝦的腹節特征，其包括的忠縣群體和高郵群體的信息比其它群體更為豐富，所以這10個群體的形態差異主要集中在腹節因子上。

判別分析是用來判別對象所屬分類的一種統計分析方法，它主要通過觀測已知樣品的數據來構建一個判別函數，通過構建的函數來對未知樣品進行分類[18]。陳杰等[19]對不同鳊魴屬魚類進行判別分析，建立了6個判別函數，判別準確率在82%至100%之間。張帥[20]對138尾蓋子紅七彩神仙進行判別分析，建立了雌雄判別方程，雄魚的準確率為71.4%，雌魚的準確率為87.7%。本研究結果中，雌性群體中的南京群體判別率達到93.1%，表明對于南京群體的判別效果較好。雄性群體中，宜賓群體、南京群體和無錫群體的判別效果較好，判別準確率分別是100%，95.2%，85.7%，表明可以對這3個群體的雄性克氏原螯蝦進行有效的判定。但雌雄的綜合判別率較低，雌性為64.7%，雄性為65.6%。這可能是由于采樣群體在形態上的差異并不顯著，判別分析無法根據形態差異對群體做出正確率較高的分類。

現在的分類學家一般將亞種視為分類的最小單位，但有學者認為在亞種的水平下還可以進行不同種群的分類，并提出了差異系數的概念[21]。從Mayr等[22]將差異系數(CV)值1.28視為界定亞種水平的標準來看，本研究大部分形態比例參數的差異系數值小于1.28，說明這10個不同水域群體的克氏原螯蝦群體的形態差異并未達到亞種水平。Avise等[23]認為亞種間的形態差異需同分子差異保持一致，雖然形態差異分析不能夠準確地判定群體之間差異，但可為后續分子研究提供參考。

3.2 克氏原螯蝦雌雄形態差異分析

T檢驗結果顯示，雌雄克氏原螯蝦的主要差異集中在體重、頭胸甲長、頭胸甲寬和腹節總長上，且雄性螯蝦的平均體重比雌性要重，頭胸甲平均長度比雌性長，頭胸甲平均寬度也比雌性寬，但腹節總長平均值比雌性要小。而全長相同的情況下雄性體重一般大于雌性，可能與雄性克氏原螯蝦的兩只大螯通常比同體型的雌性的兩只螯要粗壯以及雄性的頭胸甲長長于雌性等有關。全長相同的情況下雄性的腹節總長短于雌性可能與克氏原螯蝦雌蝦抱卵、孵化幼苗的習性有關。

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