KK-42對日本沼蝦表皮蛋白基因MnCP-1表達的上調效應

苗澤龍，黃亞龍，呂艷杰，寧黔冀

(河南師范大學生命科學學院，河南新鄉 453007)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)隸屬于軟甲亞綱(Subclass Malacostraca)十足目(Order Decapoda)長臂蝦科(Palaemonidae)沼蝦屬(Macrobrachium)，是我國十分重要的淡水食用蝦，其堅硬的表皮可以預防外界有害機體的物質進入，防止機體內部水和離子的丟失，表皮中的有機物主要是幾丁質和表皮蛋白(cuticle proteins，CPs)[1]，大多數的CPs都能結合幾丁質構成網狀結構。根據其氨基酸序列的不同將CPs劃分為不同的家族，其中CPR (Cuticular Protein with Rebers Riddiford Consensus)家族是CPs中最大的家族，包含有保守的RR基序(Rebers-Riddiford consensus sequence)[2,3]，即Gx8Gx6YxAxExGYx7Px2P(其中x代表的是任意一種氨基酸殘基)，該基序現在被公認為是結合幾丁質的保守域，能夠促進幾丁質纖維和蛋白質基質間的相互作用[4,5]。在昆蟲中對CPs的研究較為廣泛，根據RR序列的變異程度進一步劃分為三個亞族：RR-1，RR-2和RR-3[6]。而對甲殼動物CPs的研究報道相對較少，目前，通常以是否含有幾丁質結合-4(chitin_bind_4，又叫pfam00379)結構域作為判斷CPs的主要依據[4]，該結構域其實是RR-1和RR-2亞族CPs的復合物[2]。

理論上，CPs的表達應該與甲殼動物的蛻皮周期有關。采用直接分離純化方法，先后從日本對蝦(Penaeusjaponicus)尾扇[7,8]、藍蟹(Callinectessapidus)背部表皮[9,10]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)尾扇[11-14]等發現了數目不等的CPs，根據氨基酸序列推定編碼蛋白的核苷酸序列，進而在轉錄水平上研究相關基因的表達在蛻皮周期中的變化，分析CPs在新舊表皮更替中的作用。隨著生物信息學的發展，通過足夠的已知序列信息進行基因功能的預測也已經成為一種有效的研究手段，比如Kuballa等[15]利用轉錄組測序，比較遠海梭子蟹(Portunuspelagicus)在蛻皮周期不同階段差異性表達基因的模式，探討其可能的功能。

實驗室前期研究發現，咪唑類物質KK-42可以顯著縮短日本沼蝦的蛻皮周期[16]， 推測KK-42的作用機理可能與CPs表達的改變有關。由于CPs在不同物種間的相似性較低，有關日本沼蝦CPs基因及其功能的研究目前尚未見報道。因此，本試驗結合轉錄組測序和RACE技術，從頭胸甲中克隆了一個編碼日本沼蝦CPs的全長cDNA序列，命名為MnCP-1，采用Real-time PCR分析了不同蛻皮時期MnCP-1在頭胸甲中的表達，以及KK-42處理之后不同時間點MnCP-1的表達變化，為闡明KK-42的作用機理積累資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和KK-42處理

日本沼蝦于2017年5-8月捕撈于河南衛輝順城關公園，選取健康幼蝦(體長3.0～4.0 cm)200尾隨機分為對照組和實驗組飼養于水族箱中，水溫(22±1)℃，每天早上晚上各投喂一次，一周后用于實驗。處理組使用濃度為1.95 ×10-4mol/L的KK-42浸泡1 min后迅速放入原水族箱內，按原方式喂養，同時以不含KK-42的溶液作為對照組做相同處理[17]。

1.2 RNA的提取

分別選取C期(蛻皮間期)、D0-2期(蛻皮前期早期)、D3-4期(蛻皮前期晚期)和A期(蛻皮后期)各4～5只幼蝦，快速分離頭胸甲組織，KK-42浸泡后的0、3、6、12、24和48 h的實驗組和對照組分別取C期和D0-2期的頭胸甲組織，利用Mini BEST Universal RNA Extraction Kit(TAKARA)試劑盒，按照說明書的操作步驟提取上述表皮組織的RNA。實驗重復三次。蛻皮周期的鑒定依據Cesar等[18]的方法。

1.3 RNA反轉錄為cDNA

利用反轉錄試劑盒5X All-In-One RT Master Mix(abm)，按照說明書的反轉錄條件將提取出的RNA反轉錄為cDNA模板。

1.4 MnCP-1 cDNA全長獲得

利用軟件Prime primer 5設計RACE外引物GSP-5′-outer和GSP-3′-outer以及RACE內引物GSP-5′-inner和GSP-3′-inner(表1)，同時分別制備5′ RACE cDNA和3′ RACE cDNA。按照SMARTer RACE 5′/3′Kit(Clontech)說明書的操作步驟送生物工程股份有限公司測序拼接后得到MnCP-1 cDNA全長序列。

1.5 生物信息學分析

利用Conserved Domain (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)確定MnCP-1的幾丁質結合保守域，利用Open Reading Frame (ORF)Finder (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html)分析預測開放閱讀框，并推導其編碼的氨基酸序列。使用 DNAMAN 軟件對這些基因進行多序列比對分析。相對分子質量和等電點應用在線工具ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)計算，使用MEGA6.06軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining)構建MnCP-1系統進化樹。

1.6 MnCP-1的表達分析

根據引物設計原則，利用軟件Prime primer 5設計上、下游引物(表1)。按照AceQTM qPCR SYBR?Green Master Mix (Vazyme)試劑盒說明書步驟操作，β-actin為內參基因，實驗均設3個重復，采用比較Ct值(2-ΔΔCt法)計算相對表達量，使用SPSS13.0進行顯著性分析，P<0.01表示差異極顯著。

表1 實時熒光定量PCR和RACE相關引物Tab.1 Primer sequences used for Real-time PCR and RACE

2 結果

2.1 MnCP-1的序列分析

MnCP-1 GenBank登錄號為 KY065119，基因的cDNA序列全長為604 bp，包含69 bp的5′-非編碼區(Untranslated region，UTR)和166 bp的3′-UTR以及369 bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼122個氨基酸，在其3′-UTR包含多聚腺苷酸加尾信號AATAAA。幾丁質結合-4結構域位于126～281 bp(圖1)，預測的MnCP-1蛋白相對分子質量為13.394 kD，分子式為C598H909N161O186S2，理論等電點為4.41。MnCP-1與普通黃道蟹(Cancerpagurus，P81576.1)有61%的相似性(圖2)。系統進化樹顯示，MnCP-1和地中海實蠅(Ceratitiscapitata)親緣關系最近，聚為一支(圖3)。

圖1 MnCP-1全長cDNA序列和推導的氨基酸序列Fig.1 Full length sequence of MnCP-1 cDNA and deduced amino acid sequence灰色表示chitin_bind_4結構域，細線方框加粗字母表示RR基序保守位點，*表示終止密碼子

圖2 MnCP-1的保守區域氨基酸序列與其它物種的序列比對Fig.2 The alignment of amino acid sequences of putative catalytic region of MnCP-1 with those from other species黑色代表相同水平為100%，灰色代表相同水平≥50%

圖3 使用MEGA 6.06采用鄰接法構建MnCP-1的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of selected MnCP-1 constructed using the neighbor-joining method in MEGA 6.06

蚤狀溞(Daphnia pulex)EFX73274.1；大型溞(D.magna)KZR99743.1；黑脈金斑蝶(Danaus plexippus plexippus)OWR47245.1；棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)XP 021200909.1；長角長蟲兆(Orchesella cincta)ODM98266.1；地中海實蠅(Ceratitiscapitata)XP 020712733.1；藍蟹(Callinectessapidus)AAV28476.1；家蠶(Bombyxmori)NP 001166710.1；白符跳(Folsomia candida)XP 021957998.1；日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)BAA90876.1；埃及伊蚊(Aedes aegypti)XP 001659105.1；柑橘鳳蝶(Papilio xuthus)KPI97902.1；金鳳蝶(P.machaon)KPJ11380.1；普通黃道蟹(Cancer pagurus)P81576.1；美洲螯龍蝦(Homarus americanus)P81386.1；果蠅(Drosophila mojavensis)XP 002007519.2；日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)AQT18916.1 用黑三角標定

2.2 MnCP-1的表達與蛻皮周期的關系

在蛻皮周期的不同階段，頭胸甲中MnCP-1的表達量變化顯著，D3-4和A 期的表達量較高，分別是C期的27和183倍(圖4)。

2.3 MnCP-1在KK-42處理后的表達變化

KK-42對頭胸甲MnCP-1的表達有顯著的上調效應，尤其是C期和D0-2期。與對照組在各個時間點相對穩定的表達不同，C期的處理組在6、12、24和48 h分別較對照組提高6、4、34和24倍以上(圖5)。D0-2期的表達量在3 h急劇升高達到峰值，6 、24和48 h分別比對照增高了10、26和3倍以上(圖6)。

圖4 頭胸甲內MnCP-1在蛻皮周期不同階段的表達變化Fig.4 The expression variation of MnCP-1 in carapace at different molt stagesC.蛻皮間期；D0-2.蛻皮前期早期；D3-4.蛻皮前期晚期；A.蛻皮后期；n=5/蛻皮階段；“**”表示與C期相比有極顯著差異(P<0.01)

圖5 KK-42對C期頭胸甲MnCP-1 mRNA表達的影響Fig.5 The effect of KK-42 on the expression of MnCP-1 in carapace at stage C n=5/組/時間點；“**”表示與相應對照組相比有極差異顯著(P<0.01)，下同

3 討論

CPs是構成甲殼動物表皮的基本成分，它是由上皮細胞按照一定的周期和步驟表達和合成的重要的結構性蛋白。本研究首次從日本沼蝦的頭胸甲中克隆出了含有幾丁質結合-4結構域的MnCP-1 cDNA全長(圖1)，經多序列比對，MnCP-1與甲殼動物的多種CPs的相似性在40 %～61 %之間(圖2)。系統進化樹構建表明，甲殼動物與昆蟲的CPs有著共同的祖先，隨著時間的推移，動物進化分化出了不同的CPs，其中MnCP-1與地中海實蠅的親緣關系最近(圖3)。

圖6 KK-42對D0-2期日本沼蝦頭胸甲MnCP-1 mRNA表達的影響Fig.6 The effect of KK-42 on the expression of MnCP-1 in carapace at stage D0-2

研究表明，在蛻皮前期的晚期(D3-4期)新上表皮層下出現了越來越厚的新外表皮，在蛻皮后不久(A期)，上皮細胞層會繼續在新外表皮下合成新的內表皮[19]。甲殼動物中，多數CPs的表達與蛻皮周期密切相關。克氏原螯蝦尾扇中的一種基質蛋白(被命名為Casp2)[13]和藍蟹關節膜中的兩種蛋白(被命名為CsAMP8.1和CsAMP13.4)[9,10]在蛻皮周期的D3-4期和A期表達最高，被認為參與外表皮與內表皮的形成。本研究結果與之類似，MnCP-1在D3-4和A期有高表達(圖4)，推測MnCP-1既參與了新外表皮的形成，又參與了蛻皮后新內表皮的形成。當然，在今后的研究中蛋白水平的驗證是必要的。

合成和分泌CPs的表皮上皮細胞是蛻皮激素作用的靶細胞之一，實驗室前期研究發現，KK-42能誘導日本沼蝦蛻皮激素濃度峰值提前出現[20]，與處理組MnCP-1在C和D0-2期的高表達結果一致(圖5，6)，提示KK-42可能通過提高蛻皮激素的濃度間接調節MnCP-1的表達，具體的分子機制還需進一步探究。MnCP-1在C和D0-2期轉錄水平的升高可能加快了日本沼蝦新表皮的形成，促進了蛻皮進程，從而縮短蛻皮周期。

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