基于線粒體COI和Cytb基因序列的6種錦鯉(Cyprinus carpio Koi)遺傳多樣性分析

李夢榮，田 雪，龐小磊，王良炎，胡 菊，董傳舉，李學軍，王團記

(河南師范大學水產學院，河南新鄉 453007)

錦鯉(CyprinuscarpioKoi)屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯉屬(Cyprinus)。鯉科為魚類中最大的一個科，分布廣泛[1]。錦鯉體表被鱗色彩艷麗、花紋多變，具極高的觀賞和飼養價值，是風靡當今世界的一種體型較大的觀賞魚類，素有“會游泳的藝術品”、“水中活寶石”等美稱[2，3]。經過200多年的培育，錦鯉中出現了眾多品系，可分為13類126種[4]，錦鯉品系一般由雜交和長期的人工選擇獲得，在觀賞和養殖過程中主要是以色斑來進行挑選與分類，因此，即使表形特征一樣的個體，其基因型卻可能存在極大的差異，這也導致其遺傳背景十分復雜，體色變化有很強的不確定性，所以在養殖過程中找到體色穩定遺傳的錦鯉必須萬中挑一[5]。

現今，關于鯉科魚類種屬間系統發育關系的報道較多，但錦鯉養殖品系間的親緣關系研究很少，多利用形態學[6，7]或微衛星標記[8，9]方法對紅白錦鯉、昭和錦鯉、大正錦鯉和烏鯉進行遺傳分析，其它主要養殖品系間的遺傳差異尚不清晰。魚類線粒體基因是結構高度緊湊的共價雙鏈閉環分子[10]，長度約為15～20 kb[11]，具有分子小、進化速度快、結構簡單和母性遺傳[12]等特點，在分子遺傳學領域應用較多。本研究以河南師范大學水產養殖基地培育的6個錦鯉養殖品系為研究對象，利用線粒體COI和Cytb基因分析錦鯉養殖品系間的遺傳差異，探討各品系間的進化和親緣關系，為錦鯉的系統進化提供分子生物學依據，也為優質錦鯉選育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 研究樣品來源及總DNA提取

6個錦鯉品系為河南師范大學水產養殖基地培育，表1為品系的名稱和數量等信息。酚-氯仿抽提法從錦鯉鰭條組織中提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。

表1 錦鯉品系的名稱和數量Tab.1 C.carpio Koi sample names and quantity

1.2 COI和Cytb基因擴增及序列測定

根據NCBI中錦鯉COI基因和Cytb基因序列設計特異性引物進行PCR擴增，具體引物序列如下：正向引物COIF(AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC)、CytbF(AACCACCGTTGTATTCAACTACAA)和反向引物COIR(CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC)、CytbR(ACCTCCGATCTTCGGATTACAAGACCG)，由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。PCR反應體系：2×PCR Taq MasterMix12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.75 μL、DNA模板1 μL，補足dd H2O到25 μL。PCR擴增條件為：預變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共30個循環，終延伸72 ℃ 5 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送武漢天一輝遠生物科技有限公司、金斯瑞公司和生工進行測序。

1.3 序列分析

測序結果用Clustalx 2.1軟件進行比對，MEGA7.0[13]計算線粒體COI和Cytb基因序列的堿基組成，確定變異位點和簡約信息位點的個數，群體內和群體間的遺傳距離。DNAsp v.5[14]統計單倍型個數，計算單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)和核苷酸多樣性(π)等。Arlequin3.1[15]計算品系間的遺傳分化系數等。MEGA7.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建單倍型和品系全部個體的系統進化樹，系統樹各節點支持率采用Bootstrap 1 000次重復檢驗置信度[16]。

2 結果

2.1 序列與單倍型分析

用于進行品系間分析的COI基因序列長602 bp，A、T、G、C的平均堿基含量分別為26.6%、30.4%、18.5%、24.5%。其中包括594個保守位點，8個變異位點，3個簡約信息位點。COI基因中檢測到的7種單倍型及單倍型序列變異位點見表2，其中H1、H2、H4為群體間共有單倍型， H3為黑錦鯉(HL)所特有，H5為全白錦鯉(QB)所特有，H6、H7為全紅錦鯉(QH)所特有。

用于進行品系間分析的Cytb基因序列長1 117 bp，A、T、G、C的平均堿基含量分別為29.5%、26.5%、13.8%、30.2%。其中包括1 102個保守位點，15個變異位點，12個簡約信息位點。Cytb基因中檢測到的6種單倍型及單倍型序列變異位點見表3，其中HH1、HH2、HH4為群體間共有單倍型，HH3為HL所特有，HH5為QB所特有，HH6為QH所特有。

6個錦鯉品系基于COI和Cytb基因序列的遺傳多樣性結果如表4所示，COI基因序列Hd在0.436±0.133～0.709±0.083之間，π在0.000 7±0.000 2～0.003 0±0.000 6之間。Cytb基因Hd在0.318±0.164～0.709±0.083之間，π在0.001 6±0.000 5～0.005 0±0.001 0之間。所有品系COI和Cytb的Tajima’s D中性檢驗結果為-1.370 7～1.448 8、-1.704 6～1.905 7，中性檢驗結果均不顯著(P>0.05)，符合中性突變。

表2 COI基因單倍型及在6個品系的分布Tab.2 Haplotypes of COI gene and its distribution in 6 varieties

表4 6個品系基于線粒體COI和Cytb基因序列的遺傳多樣性指數Tab.4 Genetic diversity index base on COI and Cytb sequence in 6 varieties

2.2 品系間的遺傳距離及遺傳分化

利用線粒體COI和Cytb基因序列比較6個品系的遺傳分化系數，根據軟件AMOVA結果顯示，品系內遺傳差異高于品系間的差異(表5)。 表6所示，基于COI基因的6個養殖品系群體間遺傳分化系數FST在-0.029 1～0.623 8之間，SS和QB之間的遺傳差異最大，為0.623 8，HL和QH間遺傳差異最小，為0.059 9；HJ和QB之間的遺傳距離最近，為0.001 6，SS和QH之間的遺傳距離最遠，為0.003 6。并且QB品系內遺傳距離最小，為0.000 7，HL的種內遺傳距離最大，為0.003 0，經比對，遺傳距離與FST分析結果基本一致。

基于Cytb基因的6個養殖品系FST在-0.041 5～0.690 2之間，SS和QH間遺傳差異最大，為0.690 2，HJ和QH間遺傳差異最小為0.108 0；QH和QB之間的遺傳距離最近，為0.003 0，SS和QH之間的遺傳距離最遠，為0.007 2。此外，QB品系內遺傳距離最小，為0.001 6，HL的種內遺傳距離最大，為0.005 0，經比對，遺傳距離與FST分析結果基本一致(表7)。

表5 6個品系線粒體COI和Cytb序列的AMOVA結果Tab.5 The result of AMOVA based on COI and Cytb gene of mtDNA in 6 varieties

表6 基于COI基因的6個品系間平均遺傳距離、FST值及各個品系內平均遺傳距離Tab.6 average genetic distance between and within 6 varieties and FST

注:對角線以上為群體間的遺傳距離，對角線以下為群體間的FST，*表示差異顯著(P<0.05)。表7同。

表7 基于Cytb基因的6個品系間平均遺傳距離、FST值及各個品系內平均遺傳距離Tab.7 average genetic distance between and within 6 varieties and FST

2.3 系統進化樹

根據COI基因和Cytb基因單倍型構建品系之間的NJ系統進化樹(圖1、2)。從圖1、圖2中得到，6個品系可分為三支， HL、QH聚為一支；SS、HB、HJ聚為一支，QB單獨聚為一支。因此，HL和QH親緣關系較近，SS、HB和HJ親緣關系較近,QB與其他品系的親緣關系均較遠。

圖1 基于鄰接法構建的COI基因單倍型系統發育樹Fig.1 Neighbor-joining tree of COI gene haplotypes

圖2 基于鄰接法構建的Cytb基因單倍型系統發育樹Fig.2 Neighbor-joining tree of Cytb gene haplotypes

3 討論

3.1 序列及單倍型

本研究分析并比較了6個錦鯉養殖品系線粒體COI和Cytb基因部分序列的堿基差異。結果顯示錦鯉各品系COI和Cytb基因序列中G含量最低(18.5%/13.9%)，且AT含量(57%/56%)明顯高于GC含量(43%/44%)，這與魚類線粒體基因堿基組成中存在的反G偏倚現象相一致，大部分生物基因組中出現的堿基偏向性現象十分廣泛，且不同種屬的堿基不均衡程度也不盡相同[17]。產生這一現象的原因有：基因長度、基因的表達水平、堿基組分以及密碼子反密碼子間的結合能力等[18]。

7個COI基因單倍型中單倍型H1、H2和H4為群體所共有，且這3種單倍型的個體數為51個，占總數的82.26%， 6個Cytb基因單倍型中H1、H2和H4單倍型為群體所共有，且具有這3種單倍型的個體數為52個，占總數的83.87%，推測單倍型H1、H2和H4很可能是較原始的單倍型類型。基于COI和Cytb基因研究的6個品系中紅白錦鯉均具有最高的Hd值，黑錦鯉具有最高的π值，這可能與錦鯉的選育歷史有一定的關系，Kock等[19]研究證實：黑錦鯉和紅白錦鯉處于較原始的位置，通常以黑錦鯉和紅白錦鯉為親本選育其他品系類型。

3.2 群體間的親緣關系分析

單倍型結果顯示，COI基因和Cytb基因都能夠區分其中一些品系(黑錦鯉、全白錦鯉、全紅錦鯉)，但多數品系不具有獨特的單倍型(所有的品系共享單倍型H1；黑錦鯉、三色錦鯉、紅白錦鯉共享單倍型H2；三色錦鯉、紅白錦鯉、黃金錦鯉、全紅錦鯉共享單倍型H4)，遺傳距離結果與單倍型結果一致，SS、HB、HJ遺傳距離較近，SS和QH之間的遺傳距離最遠。NJ系統進化樹結果同樣顯示，黑錦鯉和全紅錦鯉親緣關系較近，三色錦鯉、紅白錦鯉和黃金錦鯉親緣關系較近，全白錦鯉單獨聚為一支。錦鯉雜交遺傳圖譜、Pietsch等[20]和Kock等[19]的研究顯示，黑錦鯉和全紅錦鯉由鐵真鯉(C.carpioTetsu Magoi)選育而來，因此它們的親緣關系較近，聚為一支。紅白錦鯉和黃金錦鯉由淺黃真鯉(C.carpioAsagi Magoi)選育產生，三色錦鯉由紅白錦鯉選育而來，因此它們的親緣關系較近，聚為一支。全白錦鯉雖然也由淺黃真鯉選育產生，但選育過程冗長，經歷了多代雜交篩選，與其他品系的親緣關系相對較遠，但不排除個別個體與其他品系的親緣關系較近。除全白錦鯉外，黑錦鯉、全紅錦鯉和三色錦鯉、紅白錦鯉、黃金錦鯉存在一定的交集，產生這種結果的原因可能是與錦鯉選育歷史和市場流行趨勢相關，現今品系選育大都以觀賞性狀為目標，通過種間雜交達到培育優質錦鯉的目的，也導致錦鯉基因雜合度高，遺傳背景復雜。

3.3 單倍型分析的可行性

相較于其他分子標記，DNA序列分析[21]可更準確直接地反映物種的遺傳多樣性。魚類線粒體基因中，COI基因和Cytb基因具有進化速率適中、易擴增、易排序[22]及富含系統發育信息[23]等優點，被廣泛應用于種群遺傳多樣性研究、魚類種質資源狀況調查、物種鑒定及分子系統發育探究[7，24-27]。

本實驗利用線粒體COI和Cytb基因對6個錦鯉養殖品系進行遺傳多樣性分析，明確品系間親緣關系，為培育優質錦鯉品系提供研究基礎，為錦鯉的遺傳選育和種質保護提供一定的理論數據。

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