安徽省10個(gè)日本沼蝦群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分析

陳 靜，宋光同，何吉祥，黃 龍，吳本麗，汪 翔，武 松

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，合肥 230031)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)俗稱青蝦、河蝦，隸屬甲殼綱(Malacostraca)十足目(Decapoda)長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)沼蝦屬(Macrobrachium)，廣泛分布于我國(guó)各淡水水體，是我國(guó)一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大的淡水蝦類[1-4]。隨著日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，出現(xiàn)了如種質(zhì)資源退化，性早熟、生長(zhǎng)慢、規(guī)格變小、抗病力下降等一系列的問題；另外，由于無序開發(fā)及天然生境的變化等因素使得野生優(yōu)異種質(zhì)也遭到一定程度的破壞，資源量下降，限制了日本沼蝦的可持續(xù)發(fā)展。因此，日本沼蝦的種質(zhì)資源研究逐漸被重視并廣泛開展[4-10]。

安徽省地跨長(zhǎng)江、淮河、新安江三大流域，境內(nèi)巢湖是全國(guó)五大淡水湖之一，水資源相當(dāng)豐富，是我國(guó)日本沼蝦的主產(chǎn)區(qū)之一，其中2016年養(yǎng)殖產(chǎn)量為5.31萬(wàn)t，位居全國(guó)第二[11]。目前僅見姜虎成等[7]對(duì)淮河安徽段日本沼蝦的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，未見安徽其他水域日本沼蝦的遺傳多樣性相關(guān)報(bào)道。本研究采用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)安徽主要水域的日本沼蝦進(jìn)行遺傳多樣性研究，客觀評(píng)價(jià)安徽日本沼蝦的遺傳結(jié)構(gòu)和種質(zhì)資源現(xiàn)狀，為日本沼蝦種質(zhì)資源保護(hù)和合理挖掘利用以及良種選育提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2016年10月，采集安徽省日本沼蝦主要野生群體6個(gè)，養(yǎng)殖群體4個(gè)(表1)。樣品活體運(yùn)回測(cè)量形體指標(biāo)后取其腹部肌肉，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 日本沼蝦樣本采集地點(diǎn)及數(shù)目Tab.1 Sample sites and numbers of M.nipponense

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的組織基因組提取試劑盒(DP304)提取基因組 DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè) DNA 的純度和濃度，并稀釋至10 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星檢測(cè)

根據(jù)公開發(fā)表的日本沼蝦多態(tài)性較好的微衛(wèi)星標(biāo)記[10，12-13]，選取20個(gè)標(biāo)記經(jīng)初步PCR篩選后，挑選出重復(fù)性好、多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標(biāo)記10個(gè)(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。各對(duì)引物的正向引物5′端分別帶有FAM(藍(lán)色)或HEX(綠色)的特異性熒光標(biāo)記用于測(cè)算擴(kuò)增目的條帶的大小。

PCR 反應(yīng)體系為15 μL，包括模板DNA 1 μL，10×buffer 1.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)各0.3 μL，上下游引物(10 pmol/L)各0.15 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 0.3 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸3 min。

將PCR產(chǎn)物委托上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行SSR分型。10倍稀釋的PCR產(chǎn)物1.5 μL、ROX 500內(nèi)標(biāo)0.25 μL和超純?nèi)ルx子甲酰胺12.5 μL充分混勻后，95 ℃變性5 min，迅速冰浴3 min，置ABI 3700XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

表2 10對(duì)微衛(wèi)星引物的特征Tab.2 Sequence haracteristics of 10 pairs of microsatellite primers

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

用 Genographer 軟件根據(jù)分子大小對(duì)擴(kuò)增結(jié)果讀帶，統(tǒng)計(jì)每個(gè)引物在不同個(gè)體中的擴(kuò)增情況。利用POPGENE 32統(tǒng)計(jì)分析各群體每一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、群體間遺傳距離(D)。利用ARLEQUIN3.5[14]進(jìn)行群體間遺傳分化指數(shù)和群體分子方差分析。利用Picalc程序包[15]計(jì)算各引物的多態(tài)信息含量(PIC)。基于Nei’s遺傳距離利用MEGA 5軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性

根據(jù)預(yù)擴(kuò)增結(jié)果選取特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和多態(tài)性較高的10對(duì)引物，對(duì)10個(gè)日本沼蝦群體共300個(gè)個(gè)體的基因組 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，各對(duì)引物表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性(表3)，其平均等位基因數(shù)(Na)、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均觀測(cè)雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)分別為23.9、7.83、0.685、0.875、0.864，所檢測(cè)的10個(gè)位點(diǎn)均屬于高度多態(tài)位點(diǎn)(PIC>0.5)。

表3 日本沼蝦10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性Tab.3 Allelie variability of 10 microsatellite loci of M.nipponense

2.2 群體遺傳多樣性

10個(gè)日本沼蝦群體的遺傳多樣性見表4。女山湖群體的平均Na、平均Ne、平均He和PIC均最高(Na=15.6、Ne=9.196、He=0.876、PIC=0.851)，升金湖群體的平均Na、平均Ne、平均Ho、平均He和PIC均最低(Na=12.4、Ne=6.427、Ho=0.64、He=0.795、PIC=0.753)，Ho最高的群體為巢湖群體(Ho=0.723)。綜合各參數(shù)，10個(gè)日本沼蝦群體均具有較高的遺傳多樣性，并以女山湖群體的遺傳多樣性最高、升金湖群體的遺傳多樣性最低。

表4 10個(gè)日本沼蝦群體的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity among 10 populations of M.nipponense

2.3 群體間的遺傳變異

分子方差分析如表5所示，10個(gè)日本沼蝦群體中的遺傳變異96.36%存在于群體內(nèi)，僅有3.64%的遺傳變異來自于群體間，但各群體間遺傳變異極顯著(P<0.01)。

10個(gè)日本沼蝦群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)和Nei’s遺傳距離如表6所示。群體間Fst介于0.002 8～0.114 4，屬于中低水平遺傳分化(Fst<0.15)，其中女山湖群體和太湖1號(hào)F2群體之間的遺傳分化水平最低(Fst=0.002 8)，升金湖群體和滁州群體遺傳分化水平最高(Fst=0.114 4)。群體間Nei’s遺傳距離為0.039 8～0.226 0，其中女山湖群體和太湖1號(hào)F2群體之間的遺傳距離最近(D=0.039 8)，升金湖群體和滁州群體遺傳距離最遠(yuǎn)(D=0.226 0)。

根據(jù)遺傳距離構(gòu)建UPGMA 聚類樹，如圖1所示，當(dāng)涂和南漪湖群體聚在一起，太湖1號(hào)F2代與女山湖群體聚在一起，升金湖和長(zhǎng)江東至段群體聚在一起。

表5 10個(gè)日本沼蝦群體的 AMOVA 分析Tab.5 AMOVA analysis among 10 populations of M.nipponense

注：＊＊1023次模擬檢驗(yàn)后顯示為極顯著(P<0.01)

3 討論

3.1 熒光SSR分型更高效更準(zhǔn)確

微衛(wèi)星標(biāo)記是分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSRs)，也稱短串聯(lián)重復(fù)序列(simple tandem repeats，STRs)，因其在基因組中分布廣泛、具較高的多態(tài)性、呈共顯性遺傳等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)生物種群遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳圖譜建立和 QTL 定位等研究中[16，17]。傳統(tǒng)的SSR片段分離采用聚丙烯酰胺凝膠電泳加銀染或放射顯影的方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且分辨率較低。本研究利用目前被廣泛采用的毛細(xì)管電泳技術(shù)，通過熒光標(biāo)記的PCR引物擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)區(qū)域序列，利用 ABI 遺傳分析儀對(duì)熒光標(biāo)記的DNA 片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，結(jié)合分子內(nèi)標(biāo)計(jì)算DNA片段長(zhǎng)度，使SSR分型更高效與準(zhǔn)確[18]。

表6 10個(gè)日本沼蝦群體間的Fst(對(duì)角線下)和Nei’s遺傳距離(對(duì)角線上)值Tab.6 Genetic differentiation coefficient (below diagonal) and Nei’s genetic distance (above diagonal)among 10 populations of M.nipponense

圖1 基于遺傳距離構(gòu)建的10個(gè)日本沼蝦群體的UPGMA聚類樹Fig.1 UPGMA clustering tree based on genetic distance of 10 populations of M.nipponense

3.2 遺傳多樣性

多態(tài)信息含量(PIC)是一個(gè)評(píng)價(jià)基因座位在群體中的多樣性程度的標(biāo)準(zhǔn)，平均PIC是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)。當(dāng)PIC>0.5時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；0.250.5)，可用于日本沼蝦群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的評(píng)估，同時(shí)，10個(gè)日本沼蝦群體也均屬于高度多態(tài)(PIC>0.5)。

雜合度又稱為基因多樣度，一般被認(rèn)為是度量群體遺傳變異的最適參數(shù)[20]。若群體平均雜合度高于0.5，表明該群體未受到高強(qiáng)度的選擇，擁有豐富的遺傳多樣性；若群體平均雜合度低于0.5，表明該群體遺傳多樣性較低。Ho容易受樣本大小的影響，而He更能夠反映群體的遺傳多樣性[21]。武小斌等[5]利用22個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了白洋淀、衡水湖、微山湖和洪澤湖4個(gè)地區(qū)日本沼蝦野生群體，結(jié)果顯示各群體的He介于0.515 6～0.540 3。黃有輝[6]利用7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了日本沼蝦主要產(chǎn)地的10個(gè)野生群體(白洋淀、微山湖、太湖、淀山湖、高郵湖、洞庭湖、鄱陽(yáng)湖、龍感湖、洪湖、貴州)，結(jié)果顯示各群體的He介于0.541～0.742。

研究中，安徽省10個(gè)日本沼蝦群體的平均He介于0.795～0.876，4個(gè)養(yǎng)殖群體也均具有較高的遺傳多樣性(He=0.821～0.853)，甚至超過上述報(bào)道的各野生群體，可能是與養(yǎng)殖群體每年都補(bǔ)充部分野生親本進(jìn)行種質(zhì)改良有關(guān)。總之，安徽省10個(gè)日本沼蝦群體均具有較高的遺傳多樣性及選育潛力。

3.3 群體間遺傳變異

Hamrick等[22]認(rèn)為以異交為主的物種，90%的遺傳變異發(fā)生在群體內(nèi)部，研究中AMOVA 分析結(jié)果表明，僅3.64%的遺傳變異來自于群體間，有96.36%的遺傳變異存在于群體內(nèi)部，與上述結(jié)論一致。群體間顯示，群體間遺傳分化指數(shù)介于0.002 8～0.114 4之間，屬于中低水平遺傳分化(Fst<0.15)[23]。安徽省日本沼蝦6個(gè)野生群體的Fst大小和聚類順序都與實(shí)際的地理位置分布較為一致，姑溪河、南漪湖、長(zhǎng)江東至段和升金湖均屬于長(zhǎng)江水系，其中姑溪河群體和南漪湖群體的遺傳分化指數(shù)最小(Fst=0.008)，而屬于淮河水系的女山湖群體和升金湖群體的遺傳分化指數(shù)最大(Fst=0.082 3)，日本沼蝦4個(gè)養(yǎng)殖群體的聚類也與就近的野生群體相靠近。馬克異等[9]在研究錢塘江日本沼蝦的遺傳變異時(shí)，也得出地理位置的遠(yuǎn)近與Fst 的大小具有相關(guān)性，這可能與日本沼蝦的生活習(xí)性相關(guān)，日本沼蝦游泳能力較弱，只能作短距離的游動(dòng)，多數(shù)時(shí)間攀附于水草或其他水中物體上，僅在幼苗時(shí)期隨水流或者人為攜帶而被動(dòng)擴(kuò)散[4]。

安徽省10個(gè)日本沼蝦的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究表明，10個(gè)群體均具有較高的遺傳多樣性，6個(gè)野生群體遺傳分化和聚類順序與所處的地理位置分布較為一致。本研究為安徽日本沼蝦種質(zhì)資源的深入研究提供一定的參考，并為其良種選育過程中親本的選擇策略提供理論基礎(chǔ)。

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