Small RNA高通量測序文庫分選方法比較

張磊 張清華 杜安娜 閔娟 高丁

摘 要：對于常規(guī)small RNA測序，使用Bluepinpin全自動核酸電泳與片段回收系統(tǒng)對文庫進行回收，安全，目前已被廣大測序用戶采納，但費用相對較高；而傳統(tǒng)的切膠回收方法，其使用的實驗試劑對人體有危害，同時操作繁雜，耗時較長，但費用較低。作者發(fā)現(xiàn)某些特殊樣品構(gòu)建的文庫使用兩種回收方法獲得的文庫差異懸殊，這篇文章旨在對特殊樣品的文庫使用全自動回收儀和傳統(tǒng)的切膠回收的方法進行比較。因此，在smallRNA文庫回收時，需根據(jù)不同的實驗材料與需求，選擇最優(yōu)的回收方案。

關(guān)鍵詞：smallRNA；文庫回收；分選方法

隨著高通量測序的廣泛應(yīng)用，對測序文庫質(zhì)量的要求也越來越高，文庫片段大小的分選則是文庫制備中的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)的核酸片段回收的方法是利用切膠回收，該方法比較繁瑣，且操作過程中使用到的部分試劑對人體有毒性。因此，自動化完成核酸片段回收的需求越來越強烈。Sage Science公司由此開發(fā)出了 Pippin Prep（Bluepinpin） 全自動核酸電泳與片段回收系統(tǒng)，高質(zhì)量的完成包括建庫在內(nèi)的多種實驗過程中分離純化各種大小 DNA 片段的需求。精確的片段回收對于優(yōu)化高通量測序效率、提高基因組組裝成功率和降低測序運行成本均具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

Bluepinpin 全自動核酸電泳與片段回收系統(tǒng)（ Sage Science）、3% Agarose Gel Cassettes， Dye-free（ Sage Science） 、安捷倫2100生物分析儀、安捷倫High Sensitivity DNA Kit （ Agilent ）、Novex TBE gels， 6%， 10 well （ Life Technology ）、Novex TBE running buffer （ 5× ） （ Invitrogen ）。

1.2 樣品前處理

根據(jù)特定的實驗?zāi)康模瑢悠愤M行前處理，將病毒接種細胞后進行分離培養(yǎng)，使用常規(guī)的方法提取病毒Total RNA，再加入相應(yīng)的抗體、RNase、Proteinse K、酚、氯仿等一系列的處理，再使用無水乙醇/乙酸鈉/Glycogen沉淀，置于-80℃冰箱保存。

1.3 Small RNA文庫構(gòu)建及回收

將沉淀下來的Total RNA用無酶水溶解，使用Illumina small RNA library prepare kit（ REF： 15016911），按照操作說明構(gòu)建small RNA 文庫。對構(gòu)建好的文庫分別進行切膠回收和使用Bluepinpin 全自動核酸電泳與片段回收系統(tǒng)進行回收。

1.4 對回收前和回收后的文庫進行質(zhì)檢

利用qubit 3.0對構(gòu)建好的文庫進行定量，再分別對使用兩種方法回收的文庫進行定量，比較兩種方法的回收效率。同時，使用安捷倫2100核酸檢測儀進行片段大小的檢測，以檢測回收的片段大小范圍是否符合實驗要求，并比較兩種方法對片段大小的分選能力。

2 結(jié)果與分析

對回收前和回收后的Small RNA文庫進行濃度檢測。使用qubit3.0檢測回收前，體積為30 uL，濃度為68.2 ng/uL；切膠回收后體積為30 uL，濃度為46.6 ng/uL，回收率為68.33%；使用Bluepinpin回收系統(tǒng)回收后體積為30 uL，濃度為1.58 ng/uL，回收率為2.32%。由此可見，兩種回收方法差異極為顯著。

對回收前和回收后的Small RNA文庫進行片段大小檢測。結(jié)果如右圖所示。（圖1、圖2、圖3）

結(jié)果顯示，切膠回收比使用Bluepinpin回收系統(tǒng)回收效果好，回收效率更高，片段分選更精確，且能達到上機測序的要求。

3 討論

對于該實驗中使用的測序建庫材料，由于其特殊的實驗?zāi)康模◣烨斑M行了相關(guān)的抗體處理，并在核酸溶解時加入糖原，這些抗體和糖原在建庫時被引入，并有可能一直存在于構(gòu)建好的文庫中。而Bluepinpin回收系統(tǒng)回收時要求核酸中無任何蛋白、鹽離子等雜質(zhì)，此文庫中存在的抗體和糖原可能嚴(yán)重的影響了Bluepinpin回收系統(tǒng)識別文庫中核酸片段大小的能力，從而導(dǎo)致回收效率低下，且片段大小雜亂無章，無法準(zhǔn)確回收目的片段。因此，對于此類樣品，必須采用傳統(tǒng)的切膠方法回收方可回收到目的片段。

4 致謝

感謝中科院武漢病毒研究所公共技術(shù)服務(wù)中心張配和許碧超提供的實驗方面的幫助。