少突膠質細胞的分離培養方法

孟贊 唐櫟

摘 要：改進少突膠質細胞體外培養方法。取新生24 h內SD大鼠大腦皮質組織，采用機械性吸管吹打的方法獲取細胞懸液，進行種植培養，Galc免疫細胞化學法鑒定少突膠質細胞。經Galc免疫細胞化學染色，少突膠質細胞純度達95%。采用此種方法培養出的少突膠質細胞純化度高，且方便簡易。

關鍵詞：少突膠質細胞；分離培養

一、實驗器械

鐘表鑷2把；眼科剪3把；小彎鑷3把；大剪及大鑷各1把；玻璃平皿3個；75cm2培養瓶；試管數只；試劑瓶數個彎；頭吸管1個；計數板1個；冰板1個；白磁盤1個；飯盒蓋1個；解剖鏡一臺。

二、實驗試劑

DMEM/HIGHGLUCOSE；Nueroobasal；D-hanks液（無酚紅）；0.25%胰蛋白酶；青霉素和鏈霉素雙抗；多聚賴氨酸；胎牛血清；馬血清；DNA酶；谷氨酰胺；bFGF；PDGF- AA；Galactocerebroside，GalC抗體；小鼠抗大鼠 A2B5 單克隆抗體 IgM。

三、實驗準備

取材前一天，將所有金屬器械置于同一個鋁盒中高壓消毒，玻璃器皿置于另外一個飯盒中高壓消毒，2小時后取出放到烘干箱中烘干備用。包被：將0.1mg/ml多聚賴氨酸溶液吸到六孔板/皿中，平置30分鐘后，吸棄賴氨酸溶液，晾干。用前用高壓過的去離子水洗三遍，再晾干備用。領取新生48h之內的SD大鼠。實驗前一天將高糖DMEM在孵育箱中孵育過夜。

四、實驗步驟

（1）取出高壓滅毒物品，置于超凈臺中。

（2）在冰板上放置玻璃培養皿，皿中均加入適量解剖液，預留最后一套小培養皿不加。

（3）用75%酒精泡上鐘表鑷。

（4）配制3ml0.125%胰蛋白酶：1.5mL 0.25% 胰蛋白酶；300μL 0.1% DNA酶；解剖液稀釋至3 mL。

（5）取新生24h內SD大鼠，75%的酒精消毒頭部皮膚，用眼科剪依次切開皮膚顱骨及硬腦膜，然后取出腦組織放在PBS緩沖液中，將取出的腦組織放在解剖顯微鏡下，用小鑷子剝除軟腦膜、腦干、海馬及血管組織。剩余的腦皮質切成1mm2的組織小塊，放入盛有PBS的離心管中，然后用吸管輕輕反復的吹打。

（6）用 70μm 篩網過濾，剪碎后在 0.125%的胰蛋 白酶 中 37℃消化15min，用含有血清的DMEM培養基終止胰酶消化。輕輕吹打使細胞分散后，離心機l000 r/min離心lOmin，棄去上清液，加入10%FCS+DMEM/F12的培養液重懸離心后的細胞，細胞以約106/cm2濃度種植在75cm2的培養瓶內。

（7）細胞放入5%CO2 的培養箱中培養大約40min，翻轉培養瓶幾次后吸出細胞懸液，取出已經貼壁了的貼壁細胞，主要是成纖維細胞，把細胞的懸液種植在涂有多聚賴氨酸75cm2的培養瓶中，培養瓶內加入 8至10ml的10%FCS+DMEM/F12的培養液。

（8）有細胞種植的培養瓶靜置3天，3天后隔天換液，培養至第9天。

（9）少突膠質細胞的分離與培養：在接種9天，細胞達到融合后，根據少突膠質細胞和星形膠質細胞系黏附特性的差異和生長時間的不同，本實驗采取差速震蕩法對少突膠質細胞進行分離和純化。首先在37℃恒溫搖床上低速震蕩來去除小膠質細胞（200rpm，1h—2h），此處收集小膠質細胞（收集振搖下來的細胞懸液，1000xg在4℃離心10 min，棄上清，細胞用適量完全培養液重懸，調整細胞密度，接種于培養皿中，4 h后收集未貼壁細胞。換新鮮培養液繼續培養。原混合膠質細胞培養瓶，PBS洗滌2次，加入新鮮培養液，不換液培養7 d，按上述方法再次獲得MG）更換（10%FCS+DMEM/F12）培養基，培養2～4h 后再放入37℃培養箱。在恒溫搖床上用高速震蕩法過夜（200rpm.，18～20h），此時收集的搖下來的細胞用吸管收集種植在未處理過的培養瓶上，把培養瓶放在37℃的細胞培養箱內30至60min，目的是使混雜在細胞懸液中的星形膠質細胞及小膠質細胞貼壁，然后把細胞懸液種植在涂有多聚賴氨酸75cm2的培養瓶內，培養液為含含有細胞因子的少突膠質細胞的培養液，采取半量換液法隔天換液，培養 4-5 天，促進 OPCs 分裂增殖，再次在恒溫搖床上用高速震蕩法 （180rpm，1h）分離傳代，進一步使少突膠質細胞純化。

（10）用細胞免疫熒光法鑒定少突膠質細胞并測算少突膠質細胞純度。24孔板每孔底部放置孔徑相同的的載玻片，少突膠質細胞以3×104/L的密度種植在24孔板上培養1天。1天后吸棄24孔板上的培養液，用PBS緩沖液洗滌少突膠質細胞3次，每次10min。用4%的多聚甲醛固定玻片約20min，PBS緩沖液浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS。在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min。吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋小鼠抗大鼠 A2B5 單克隆抗體，稀釋度為1：500，放入濕盒，4℃孵育過夜。第二天，PBS緩沖液浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的山羊抗小鼠 IgM 抗體，濕盒中37℃孵育1h，PBS緩沖液浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBS緩沖液5min×4次洗去多余的DAPI。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。隨機選取20個視野在熒光顯微鏡下觀察，免疫熒光染色陽性細胞為少突膠質細胞體細胞，計數攝影；同一視野于普通光條件下計數細胞總數，計算少突膠質細胞前體細胞細胞純度。