解糖類芽孢桿菌的鑒定及殺滅實驗

肖琳 陳中

摘 要：通過對菌株鑒定及DNA序列分析，確定菌株為解糖類芽胞桿菌。采用實際應用中的高效消毒劑對其進行殺滅實驗。且采用不同濃度，不同作用時間及溫度對其進行對比實驗，最后選擇濃度為500ppm復方過氧乙酸消毒劑對其進行殺滅。

關鍵詞：DNA序列分析；過氧乙酸復方消毒劑；解糖類芽胞桿菌

解糖類芽胞桿菌為生產用純水中分離出來的菌株，且在生產用水中檢出率較高。此菌細胞呈桿狀，革蘭氏染色陰性，在膨大胞囊內有橢圓形芽孢，氧化酶陽性。經DNA序列分析為解糖類芽胞桿菌。為保證食品生產用水的質量，首先對它的屬性進行研究，進而尋找能有效殺滅此菌的消毒劑和消毒條件。通過選擇過氧乙酸復方消毒劑在實驗室對解糖類芽胞桿菌進行了懸液定量殺菌試驗。

鑒定

（1）菌落特征：將細菌菌株接種在MC營養瓊脂板上35℃培養24小時，觀察菌落，發現菌落蔓延擴散，呈油脂稍透明狀，圓形，菌落淡黃色，表面干燥，無固定大小。在營養瓊脂上無可溶性色素。[1]

（2）革蘭氏染色：細胞呈桿狀，革蘭氏染色有時陽性，有時陰性，膨大胞囊內有橢圓形芽孢。

（3）觸酶：陽性。

（4）耐高溫：采用100℃熱水用煮沸法30分鐘以上才能將其殺死。

（5）DNA序列分析。

測序引物：1492R和27F

測序結果：

拉丁名：Paenibacillus glucanolyticus

中文名：解糖類芽胞桿菌

殺滅方法

2. 菌懸液制備

取純的解糖類芽胞桿菌菌種接種于營養肉湯培養基中，置37℃培養18h-24h，再劃線接種于營養瓊脂培養基平板上，于37℃培養18h-24h，挑取上述培養物中菌落，接種于營養瓊脂斜面，于37℃培養18h-24h，取上述新鮮培養物用稀釋液稀釋，即制得菌懸液。

2. 消毒劑制備

消毒劑為復方過氧乙酸消毒劑，是以過氧乙酸為主要有效成分的消毒劑，含量為4.0%-5.2%（W/V）。最終配制的有效成分含量為500ppm。

2.3 中和劑

5g/L硫代硫酸鈉、3.0%吐溫-80和3g/L卵磷脂PBS。

2.4 中和劑選擇試驗

試驗菌為解糖類芽胞桿菌，試驗分組為：①消毒劑+菌液；②（消毒劑+菌液）+中和劑；③（消毒劑+中和劑）+菌液；④中和劑+菌液；⑤正常菌對照；⑥未接種菌的培養基對照。試驗結果，以第6組不長菌，第3、4、5組組間菌數差不超過10%，第1組不長菌或長菌量遠低于第2組，第2組長菌量超過100cfu/ml，其組間菌落數誤差率不超過15%，表明所用中和劑及其濃度適宜。[2]

2.5 懸液定量殺菌試驗

試驗時，將0.5ml菌懸液先與0.5ml的小牛血清混合，加入4ml消毒液混合，作用至預定時間，取0.5ml混合液，加入4.5ml中和劑中，混勻。中和作用10分鐘，取中和后的混合液1ml接種平皿，另取0.5ml加入4.5ml稀釋液，混勻，吸取1ml接種平皿，并傾注營養瓊脂TSA并混勻。于35℃培養箱培養48小時，計數菌落數，重復試驗3次，計算殺滅率。

3 結果

3. 中和鑒定試驗結果

結果表明，所選中和劑可有效中和最高試驗濃度的消毒劑對解糖類芽胞桿菌的殘余作用（表一）

3. 殺菌試驗結果

試驗溫度在試驗溫度20±1℃條件下，按產品說明書選擇殺滅芽胞桿菌最短作用時間15分鐘。并在最短作用時間的0.5倍及1.5同時進行試驗，經過3次重復試驗證明，最低濃度500ppm，在作用時間15分鐘后，對解糖類芽胞桿菌的平均殺滅對數值>5.00。

4 實際應用

4. 清洗

用熱的純水配制2%CIP-100溶液（堿性洗滌溶液），啟動設備裝置循環程序，讓CIP-100溶液在設備和管道系統中循環不少于45分鐘，去除管道中的有機物質或油類物質，排空CIP-100溶液，然后用熱的純水ICH2929沖洗設備和管道系統不少于10分鐘。用冷的純水配制1%CIP-200溶液（酸性洗滌溶液）在系統中循環不少于45分鐘，為去除管道中的水垢，再用熱的純水沖洗設備和管道系統不少于10分鐘，取水樣檢測pH值，直至沖水樣達到中性。此清洗步驟可幫助去除管中的生物膜。

4. 消毒

用冷的純水（室溫即可）配制伏泰消毒液，使用濃度為500ppm，啟動設備裝置循環程序，讓伏泰消毒液在設備和管道系統中循環不少于30分鐘，排空伏泰消毒液，然后用熱的純水沖洗設備和管道系統裝置至少10分鐘，取沖洗水樣到化學實驗室檢測pH。如果未達到中性，繼續沖洗直至沖洗水的pH值為中性。

5 后續跟進

持續每周取水樣，進行微生物檢測，連續六個月內均未檢出解糖類芽胞桿菌，證明此消毒方法的可行性。

6 討論

過氧乙酸具有殺菌作用時間短，使用濃度低的優點，使用后分解快，無殘留，不會殘留有毒物質，不污染環境。該消毒液對鋁有輕度腐蝕作用，對銅，不銹鋼基本無腐蝕作用。[3]

參考文獻：

[1]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊.科學出版社，2001.2：57-58.

[2]衛生部衛生法制與監督司.消毒技術規范[S].北京：中華人民共和國衛生部，2002：15-28.

[3]劉曾寧，王光建.消毒劑生產及應用[M].北京：化學工業出版社，2003.9：46.