薄層色譜法檢測玉米中黃曲霉毒素Bl

馮莉

摘要：黃曲霉毒素（簡稱AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉所產生的次生代謝物，具有很強的毒性和致癌性，在自然條件下，黃曲霉毒素耐熱性強，當溫度達到280℃時才發生裂解而破壞，因此常規烹調條件下很難將其清除。本文討論應用薄層色譜法對毒性最強的黃曲霉毒素Bl進行的檢測，文中討論了薄層板的制法、點樣、展開的方法以及不同現象所對應的黃曲霉毒素Bl的污染情況。

關鍵詞：玉米；真菌毒素；黃曲霉毒素Bl；薄層色譜

中圖分類號：S513

文獻標識碼：B

文章編號：2095-9737（2018）08-0020-01

黃曲霉毒素不是單一的一種毒素，是一類結構相似的物質，包括十七種異構體。在紫外線的照射下可發出熒光，根據熒光顏色的不同，可以把黃曲霉毒素分為B族和G族。黃曲霉毒素對玉米及其制品的污染非常廣泛，對人體的危害分級屬于極毒類，對人主要引起急性中毒性肝炎和中毒性腦病。黃曲霉毒素的慢性中毒發生在高溫高濕地區黃曲霉毒素污染嚴重的地區，表現類似雷耶氏癥。動物試驗表明黃曲霉毒素具有強致癌性。其被定為I類可能致癌物，其中黃曲霉毒素Bl的毒性更是居于首位。

1 實驗原理

一定量玉米樣品粉碎至一定細度，用適當的溶劑將其中的黃曲霉毒素Bl經過一系列的提取以及濃縮操作之后在薄層板上進行薄層分離，然后在波長為365 nm的紫外光照射下能夠發出藍紫色的熒光，與標準點比對，根據其產生熒光反應的最低檢出量來對樣品中的黃曲霉毒素Bl進行定量，其最低檢出限量為0.0004 μg。

2 儀器和試劑

儀器：錘式旋風磨；樣品篩；調速振蕩器；電子天平（0.1 g）；玻璃板；薄層板涂布器；展開槽；紫外光燈；微量注射器。試劑：三氯甲烷；石油醚；甲醇；苯；乙腈；無水乙醚；丙酮；硅膠G；三氟乙酸；無水硫酸鈉；氯化鈉；黃曲霉毒素Bl標準品；次氯酸鈉溶液（25 g/L）。以上試劑未注明純度的均為分析純。

3 薄層實驗

3.1 樣品處理

由于玉米籽粒較大，污染嚴重的樣品一粒就會左右檢測結果，因此需要大量取樣，將分取的1 kg左右玉米樣品全部粉碎之后混勻，稱取充分混勻的樣品20 g于具塞磨口三角瓶中，再加入石油醚 甲醇混合液（30 mL石油醚+100 mL55%甲醇水溶液），之后置于調速振蕩器上振蕩30 min，將靜置后的溶液濾入分液漏斗，靜置直至分層，從下方將甲醇溶液放入另一具塞磨口錐形三角瓶中，移取20 mL濾液至另一分液漏斗加20 mL三氯甲烷，振搖后靜置分層。放出三氯甲烷層，經無水硫酸鈉后用慢速濾紙濾入50 mL蒸發皿中，再用少量三氯甲烷重復振搖提取并清洗過濾設備，并入蒸發皿中，將其置于通風櫥，在65℃的水浴條件下揮發后取下，冷卻并加入1 mL苯乙腈混合液（98 mL苯+2 mL乙腈），混合均勻充分溶解后，用膠頭滴管吸取清液于2 mL具塞試管中備用。

3.2 薄層板制備

用天平稱取硅膠G約3g，加入8g水，研磨成糊狀后轉移至薄層板涂布器中，涂成厚度約為0. 25 mm，長20 cm寬為5 cm的薄層板共三塊。置于空氣中干燥15 min，置于烘箱中，在100℃條件下活化2h左右，置于干燥器中備用。3.3點樣、展開與觀察

點樣：以薄層板一端距邊緣3 cm處作為基線，樣液要點在基線上，每塊薄層板寬5 cm，點樣時每點之間及邊緣的距離均為l cm，可點四個樣點，用微量注射器滴加樣液，控制每點的大小均勻一致，其直徑約為3 mm。從左到右依次為①10 μL黃曲霉毒素Bl標準使用液（0.04 μg/ mL）；②20 μL制備好的樣液；③20 μL樣液與10 μL黃曲霉毒素Bl標準使用液（0.04 μg/mL）；④20 μL樣液與10 μL黃曲霉毒素Bl標準使用液（0.2 μg/mL）。

展開與觀察：加入10 mL無水乙醚于展開槽內進行預展開12 cm吹干之后加10 mL丙酮三氯甲烷混合溶液（8mL丙酮+92 mL三氯甲烷）于另一展開槽展開12 cm。第四點的高濃度黃曲霉毒素Bl標準使用液熒光點起到定位作用；如第二點未出現熒光反應，表明樣品中黃曲霉毒素Bl含量在5μg/kg以下，此時第三點用做檢查最低檢出量是否正常產生熒光反應，如第二點出現陽性反應，第三點則起到定性作用，同時需要對樣品做確證實驗。加滴3滴三氟乙酸生成衍生物，與黃曲霉毒素Bl標準使用液產生的衍生物對比，判斷其熒光反應是否是由于樣品中存在黃曲霉毒素Bl而產生的。如果樣液熒光點的強度與第一點一致，則確證實驗之后即可認為樣品中黃曲霉毒素Bl含量為5μg/kg，如果樣液熒光點的強度大于第一點，則根據其強度稀釋樣液做展開實驗，直至樣液熒光點的強度與第一點一致，按照稀釋比例計算樣液黃曲霉毒素Bl含量。

4 結論

薄層色譜法測定玉米樣品中黃曲霉毒素Bl方法簡便易操作，對實驗條件和儀器的要求不高，然而該方法只能做定性實驗以及粗略的定量，如需準確定量則不能采用此種方法。