紅肉蜜柚PDR型轉運蛋白基因的發掘及CmPDR11—2表達與耐草甘膦初步分析

宋敏娜 姚婷婷 潘騰飛 蒲小龍 張迪 謝冬梅 潘東明

摘 要 基于紅肉蜜柚RNA-seq數據庫，篩選出50個ABC轉運蛋白家族基因，其中包含11條PDR型基因。對11條柚PDR基因進行命名和生物信息學分析。同源性分析結果表明：CmPDR11-2編碼的氨基酸序列與擬南芥中轉運百草枯除草劑的AtPDR11基因同源性最高，達69.25%，利用RT-PCR技術克隆得到CmPDR11-2的ORF序列。該序列長度為4 371 bp，編碼一個含有1 456個氨基酸的蛋白質，分子量165.138 03 ku，該蛋白屬于穩定的親水性蛋白，無信號肽，具有12個跨膜結構，定位于細胞膜。實時熒光定量PCR結果表明，草甘膦除草劑脅迫處理條件下，1～15 d處理組柚葉的CmPDR11-2基因相對表達量呈整體上升趨勢，且均高于對照組，反應迅速且持久，這表明CmPDR11-2基因表達與紅肉蜜柚耐草甘膦有關。

關鍵詞 紅肉蜜柚；PDR；CmPDR11-2；克隆；實時熒光定量PCR

中圖分類號 S682 文獻標識碼 A

Abstract Based on the RNA-seq database of ‘Hongrou miyou50 ABC transporter family genes were screened， including 11 PDR type genes. The nomenclature and bioinformatics analysis of 11 pomelo PDR genes were carried out. Homology analysis showed that the amino acid sequence encoded by CmPDR11-2 had the highest homology （69.25%） with the AtPDR11 gene that transports paraquat herbicides in Arabidopsis. The ORF of PDR gene was named as CmPDR11-2， which was a full-length of 4 371 bp， encoding a 1 456 amino acids with molecular weight 165.138 03 ku. The protein was stably hydrophilic， without signal peptide， with 12 transmembrane structure located in cell membrane. The results of real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that under the condition of glyphosate herbicide stress， the relative expression of CmPDR11-2 in the leaves treated with glyphosate for 1–15 days showed an overall upward trend， both of which were higher than the control， and the reaction was rapid and durable. This indicated that the expression of CmPDR11-2 gene was related to ‘Hong rou mi you glyphosate tolerance.

Keywords Citrus maxima ‘Hongrou miyou； PDR； CmPDR11-2； cloning； real-time fluorescence quantitative PCR

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.012

植物ABC轉運蛋白又稱腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporters— ABC轉運蛋白），是目前已知最大、功能最廣泛的蛋白家族[1]，存在于植物細胞的質膜、液泡、線粒體和過氧化物酶體中[2]，參與植物細胞生命活動的多種過程，影響產量和品質形成[3]。根據HAGO系統（基于越橘轉錄組測序的PDR轉運蛋白基因的發掘及其表達分析）命名法，植物ABC轉運蛋白基因分為八大亞族：ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG和ABCH[4]，不過目前在植物中未發現ABCH亞家族成員[5]，在擬南芥中，Kang等[6]將更簡單的ABC轉運蛋白命名為細菌型的ABCI家族。其中ABCG是最大的亞族，包含WBC（White-brown complex homologue）和PDR（Pleiotropic drug resistance）2種類型[7]。水生植物浮萍SpTUR2是第一個被鑒定的PDR基因[8]，隨后研究人員分別在擬南芥中鑒定出15個PDR轉運蛋白基因，水稻中鑒定出23個[9]，越橘中鑒定出21個[10]，近年來隨著基因克隆技術的發展，小麥、苜蓿和大豆等PDR基因也被克隆和鑒定出[11-14]。研究發現，PDR蛋白家族在植物生長素的極性轉運、脂質的降解、外源毒素的解毒、植物抗病和氣孔的功能調節等一系列過程中都發揮作用，因而備受人們關注[15]。

我國是世界上柚類生產面積最大的國家，柚子營養價值豐富，品種多，可以迎合不同人的口味需求，具有重要的農業價值和經濟價值。雜草是柑橘類果樹種植過程中的大敵，因雜草造成的減產一般達10%～20%，嚴重時達50%以上[16]。面對瘋長的雜草，化學除草劑如草甘膦因其方便、省事、省工，成為許多柑橘果農的首選。草甘膦能直接殺死雜草的根系，但如果長期施用除草劑，會降低土壤有效Fe和Zn的含量，并抑制柑橘對Fe和Zn的吸收。草甘膦在清除雜草的同時，也影響到了柑橘樹體的生長，主要表現為抑制蛋白質的合成[17]，而且若由于操作不當或噴藥時產生大量的藥霧隨風漂移，可由果樹葉片直接吸收并傳導到根系，造成果樹傷根及土壤污染板結，根系吸水吸肥能力減弱甚至消失，出現嚴重敗根黃葉，甚至枯死[18]。所以為保證果實產量和品質，在柚子生產過程中，應盡量降低草甘膦造成的不良影響。

在擬南芥已鑒定的15個PDR轉運蛋白中，發現AtPDR11可以運輸百草枯除草劑[19]。2010和2012年分別有研究表明ABC轉運蛋白家族與草甘膦抗性相關[20-21]。依據本實驗室建立的紅肉蜜柚汁胞不同發育期的RNA-seq數據庫，篩選出11條PDR轉運蛋白基因，對這11條柚PDR基因進行命名和生物信息學分析。同源性分析結果表明，CmPDR11-2編碼的氨基酸序列與擬南芥中轉運百草枯除草劑的AtPDR11基因同源性最高，達69.25%，草甘膦和百草枯都是滅生性除草劑，均只有接觸綠色組織后才有殺傷作用，兩者都能干擾葉綠素的合成和影響植物光合作用[22-23]，故推測CmPDR11-2有可能具有轉運草甘膦除草劑的功能。本研究利用RT-PCR技術從紅肉蜜柚葉片中克隆得到CmPDR11-2的ORF序列，采用實時熒光定量技術檢測草甘膦除草劑脅迫下CmPDR11-2在柚葉中的表達特性，以深入探究PDR轉運蛋白在蜜柚的外源毒素的解毒過程中的作用，對利用蜜柚中ABC轉運蛋白家族基因進行耐草甘膦除草劑的品質改良具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為福建農林大學園藝學院田間實驗室種植的八年生的紅肉蜜柚的葉片。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 選取長勢一致、外形接近的2株紅肉蜜柚植株，再分別選取長勢一致的主枝，對其中一株葉片噴灑純凈水，以做對照；另一株噴灑草甘膦。使用量為葉面開始滴水為止。為了營造脅迫環境，草甘膦使用量為正常生產用藥的兩倍，并加入1%的吐溫20。取處理前和處理后1、2、4、8 d和直至外觀出現明顯差異的第15 d共6次樣品，每個時間點取3個生物重復，洗凈表面后液氮速凍，存于80 ℃冰箱。

1.2.2 柚PDR基因的篩選 基于本實驗室擁有的紅肉蜜柚汁胞不同發育期的RNA-seq數據庫，通過在KEGG Orthology中關鍵字ATP-binding cassette篩選，得到77條目的基因，接著，將這77條目的基因在NCBI和甜橙庫BLAST后，最終篩選到50條ABC轉運蛋白基因。其中ABCA亞族2條、ABCB亞族10條、ABCC亞族9條、ABCD亞族2條、ABCG亞族22條、ABCE亞族1條、ABCF亞族3條、ABCI亞族1條。其中在ABCG亞族中有11條目的PDR基因。

為進一步確定所獲得的11條序列是否確為PDR基因，在擬南芥信息資源庫（http：//www.-arabidopsis.org/）下載擬南芥15條PDR的蛋白序列，然后使用SMART和NCBI對獲得的蛋白序列進行保守結構域分析，以其為模板，繼續分析柚PDR的保守結構域，然后利用MEGA 5.2軟件進行系統進化樹的構建，并將柚11條PDR基因與甜橙、擬南芥數據庫進行序列比對，最后結合系統進化樹對其進行命名。

1.2.3 柚 PDR 基因的生物信息學分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對11條柚PDR基因編碼區進行蛋白質基本理化性質進行分析；利用Plant-mPLoc（http：//www.?csbio.?sjtu.?????-edu.cn/bioinf/plant-multi/）對其進行蛋白質亞細胞定位預測；利用SignalP 4.1（http：//www.cbs.?dtu.?-dk/services/SignalP/）進行信號肽預測；利用（http：//www.?cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對其進行蛋白質跨膜結構預測；在擬南芥數據庫（http：//www.arabidopsis.org/）查找并下載AtPDR11的氨基酸序列，利用NCBI-ORFfinder （https：// www.????ncbi.?nlm.nih.?gov/orffin?der/）查找并下載11條柚PDR基因的最大ORF的氨基酸序列，并利用DNAMAN 8軟件分別與AtPDR11進行比對。

1.2.4 總RNA提取與cDNA第一條鏈的合成 RNA提取使用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒，購于北京百泰克生物技術有限公司。分別提取0、1、2、4、8、15 d的對照組和處理組的葉片的RNA。依照試劑盒說明書操作。

用于RT-PCR的逆轉錄使用TRANS生物公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒

用于qPCR的逆轉錄使用Takara生物公司的PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒。依照試劑盒說明書操作。

1.2.5 CmPDR11-2的引物設計與合成 以紅肉蜜柚轉錄組測序數據中GLEAN10014435為模板，利用Primer Premier 5軟件設計引物克隆CmPDR 11-2全編碼區。引物序列為CmPDR11-2-F： 5′- ATGAGTATTAGAGTGGCAGATGATCTAGCAAG-3′，CmPDR11-2-R：5′-TTATCTCCTTTGGAA?G-TTGTTGATGGCATAG-3′。委托華大基因公司合成。

利用Beacon Designer 8軟件設計引物。再利用Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.?gov/ tools/primer-blast/）進行引物特異性分析、UNA?Fold（http：//www.idtdna.com/UNAFold）對目標序列進行二級結構分析、Beacon Free Edition（http：// www.premierbiosoft.com/）對引物二級結構進行分析。最后篩選出的定量引物需要滿足引物特異性好，目標序列無二級結構，引物無二級結構或者自由能低。CmPDR11-2-F：5′-CTC?ATG?ACTG-CCACCATCGC-3′，CmPDR11-2-R′：5′-GGCTGCC-CTTTCACGGTAGT-3′。委托華大基因公司合成。

1.2.6 CmPDR11-2的克隆 以紅肉蜜柚葉片的cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為25 μL，其中10×TransTaq HiFi BufferⅡ2.5 μL，dNTPs（10 mmol）2 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，模板1 μL，TransTaq HiFi DNA polymerase 0.5 μL，加水至終體積25 μL。反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min 30 s，35個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR反應結束后電泳檢測，將目的片段回收、連接、轉化、測序。

1.2.7 草甘膦脅迫下CmPDR11-2基因表達分析 定量PCR使用Takara生物公司的SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus），反應體系為15 μL：SYBR Premix Ex Taq 5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，水3.2 μL。模板為0、1、2、4、8、15 d時對照組和草甘膦處理組的植株葉片的cDNA。反應條件：95 ℃ 30 s（預變性過程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環（PCR反應過程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s（溶解曲線分析過程）。在耶拿Qtower2.2熒光定量儀上進行qPCR，每個樣品進行3個技術重復。內參基因為β-Actin[24]，Actin-F：5-AGAACTATGAACTGCCTGATGGC-3，Actin- R：5-GCTTGGAGCAAGTGCTGTGATT-3。利用2CT法對CmPDR11-2在柚葉中的表達進行 分析。

2 結果與分析

2.1 柚PDR基因的篩選分析

結構域分析結果顯示，擬南芥PDR基因和柚PDR基因均具有AAA+類型的ATPase的結構，均屬于ABC轉運蛋白家族。擬南芥15條PDR基因和柚11條PDR基因的系統進化樹如圖1所示，結果表明柚PDR基因家族與擬南芥PDR基因家族親緣關系很近，也進一步驗證了我們篩選的結果的正確性。

柚11條PDR基因與甜橙、擬南芥數據庫進行核苷酸序列比對，每條序列擬南芥比對結果以分值從高到低列出，整理得出比對分值較高的擬南芥基因有AtPDR1、AtPDR3、AtPDR6、AtPDR7、AtPDR8、AtPDR9、AtPDR11、AtPDR12、AtPDR14等共9個，這9個基因均屬于擬南芥PDR型轉運

蛋白家族基因。在與甜橙比對結果中發現，除CmPDR12-1與甜橙基因一致度相對較低，為82%外，其他基因與比對的甜橙基因一致度均高達100%。最終確定這11條柚PDR基因篩選正確。并對柚11條PDR基因進行命名（表1）。

2.2 柚PDR基因生物信息分析結果

蛋白質基本理化性質預測分析顯示（表2），柚PDR基因編碼區序列長度為3 660～4 515 bp，編碼1 219～1 504個氨基酸，編碼蛋白分子量為137.731 58～170.472 48 ku，理論等電點為6.55～ 8.99，有兩個不穩定蛋白CmPDR9和CmPDR11-3，其余穩定，總平均親水性除CmPDR9和CmPDR1外皆為正值，推測CmPDR9和CmPDR1為親水性蛋白，其余為疏水性蛋白。信號肽預測結果顯示柚11條PDR基因均不包含信號肽；跨膜結構預測結果顯示11條PDR基因均具有10個以上跨膜區；亞細胞定位預測結果顯示11條PDR基因均定位于細胞膜。與AtPDR11氨基酸序列比對結果顯示同源性最高的是CmPDR11-2，為69.25%；最低的是CmPDR9，為45.04%。

2.3 CmPDR11-2基因克隆

CmPDR11-2克隆產物為一條約4 400 bp的亮帶（圖2），將其連入blunt-zero克隆載體，菌液驗證后送鉑尚生物公司測序，測序結果與紅肉蜜柚轉錄本GLEAN10014435基因編碼區序列完全一致，說明已經完全獲得了目的基因，該基因全長為4 371 bp。

2.4 草甘膦脅迫下CmPDR11-2表達分析

處理前和處理后15 d時對照組和處理組葉子外觀進行比較，處理前兩組葉片外觀正常，處理后15 d時，對照組葉片外觀依然正常，處理組葉片明顯發黃，對比明顯（圖3）。

實時熒光定量結果（圖4）顯示草甘膦處理后1～15 d，對照組CmPDR11-2基因相對表達量基本不變，處理組CmPDR11-2基因相對表達量成整體上升的趨勢，且處理前對照組和處理組基因相對表達量幾乎相等；草甘膦處理后第1天，處理組的基因相對表達量約為對照組的2.3倍，差異極顯著；第2～4天，處理組基因相對表達量約為對照組的4倍，差異極顯著；第8天，處理組的基因相對表達量約為對照組的5.7倍，差異極顯著；第15天，即外觀呈現明顯差異時，處理組基因相對表達量約為對照組的8倍，差異極顯著。

在草甘膦脅迫處理后1 d時，處理組與對照組就呈現極顯著差異，說明CmPDR11-2參與草甘膦脅迫響應，且反應迅速；至外觀出現明顯差異時，CmPDR11-2的相對表達量持續上升，說明該基因在參與草甘膦脅迫響應時，反應持久，這表明CmPDR11-2基因表達與紅肉蜜柚耐草甘膦有關。

3 討論

ABCG亞族是NBD-TMD反向序列結構域類型的轉運子，包括PDR和WBC兩種類型，在目前發現的PDR基因只存在于真菌和植物中，并且是ABC轉運蛋白家族中最多的一種類型。當植物長期處于生物或非生物脅迫時，能夠形成多種組成型或誘導型防御反應來適應環境變化來維持生存。植物PDR轉運蛋白能夠通過轉運次生代謝物質參與到植物誘導型防御反應中，從而降低脅迫環境對植物造成的不利影響。隨著基因組測序技術的提高，植物中越來越多的PDR基因被發現與克隆，但幾乎都集中在模式植物如擬南芥或者水稻，且大部分功能還未闡明。目前，紅肉蜜柚基

因組測序工作已經完成，但是關于ABC轉運蛋白家族的研究還處在起步階段，本研究依據紅肉蜜柚基因組數據庫發掘出11條蜜柚PDR亞族基因，為蜜柚ABC轉運蛋白家族的研究提供新思路，也可彌補在植物界對于ABC轉運蛋白家族的研究都幾乎集中在模式植物的不足。

本研究通過CmPDR11-2基因的克隆及對草甘膦脅迫響應表達規律分析，發現CmPDR11-2基因表達與紅肉蜜柚耐草甘膦有關。Tani等[25]發現外界環境能影響小蓬草草甘膦耐受型和草甘膦敏感型的關鍵ABC（EPSPS1、M10和M11）基因的表達，35 ℃、光照條件下，草甘膦耐受型植株的EPSPS1、M10和M11基因的表達量在不同濃度草甘膦脅迫下均高于草甘膦敏感型植株內的表達量，其中EPSPS1在草甘膦1倍濃度、M10于8倍濃度、M11于1和8倍濃度下時差異最顯著，而在35 ℃、黑暗條件下時，EPSPS1、M10和M11基因表達量明顯降低，且差異不明顯，24 ℃、光照條件下時的結果與35 ℃、光照條件下非常相似，可見光照可影響ABC基因響應草甘膦脅迫的機制。在擬南芥中，AtPDR11可以運輸百草枯除草劑，百草枯為速效觸殺型滅生性季胺鹽類除草劑，對葉綠體層膜破壞力極強，使光合作用和葉綠素合成很快中止，CmPDR11-2在柚11條PDR基因中與AtPDR11同源性最高，達69.25%，綜上，CmPDR11-2的耐草甘膦性很可能與光照條件有關。

但是本研究中處理組柚葉內CmPDR11-2表達量何時回落正常表達水平應進一步研究，且為了試驗的完善性，應設置光照和黑暗條件，分別對不同濃度草甘膦脅迫下對照組和處理組柚葉內CmPDR11-2的表達量情況進行分析。

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