棉花SSR標記在紅麻中的通用性

方書生 謝雄峰 祁建民 張列梅 徐建堂 林荔輝 張立武

摘 要 紅麻與棉花屬于錦葵科不同屬的天然纖維作物，利用棉花SSR引物的通用性可以豐富紅麻SSR標記。本研究從陸地棉每條染色體上隨機均勻挑選10對SSR引物，共260對，對24份不同來源的紅麻種質進行多態性分析。結果顯示，139對（53.5%）引物擴增出了清晰的條帶，128對（49.2%）引物表現出多態性，共擴增出292條帶，平均每對引物擴增出2.1條帶，平均多態信息量為0.5419。表明這些引物在紅麻中的通用性和多態性好。位于陸地棉染色體A1、A5和D8上的SSR引物在紅麻中擴增多態性較高。聚類分析表明，24份紅麻種質可分為2個類群，進一步劃分為4個亞群，與地理來源和系譜關系較一致。這些結果既證實了棉花SSR引物應用于紅麻是可行的，又有助于紅麻與棉花比較基因組學和遺傳育種研究。

關鍵詞 紅麻；SSR引物；遺傳多樣性；通用性

中圖分類號 S31 文獻標識碼 A

Abstract Kenaf and cotton are natural fiber crops of the Malvaceae family in different genera， universality of SSR primers from cotton could enrich the SSR markers of kenaf. In this study， ten pairs of SSR primers were randomly and evenly selected from each chromosome of upland cotton. Totally， 260 pairs were used to test the polymorphism of 24 different varieties of kenaf. The results showed that 139 （53.5%） pairs of primers amplified clear bands， 128 （49.2%） pairs presented polymorphism. In total， 292 bands were amplified， and an average of 2.1 bands was amplified for each primer. The average of polymorphic information content was 0.5419. All these indicated that these primers from upland cotton had good universatility and polymorphism in kenaf. The SSRs locating on chromosomes A1， A5， and D8 on upload cotton showed high polymorphism in kenaf. Cluster analysis indicated that the 24 kenaf varieties could be divided into two groups， which were further divided into four subgroups， in according with geographical sources and pedigrees. These results confirmed that cotton SSR primers could be suitable for kenaf and be useful in comparative genomics and genetic breeding between kenaf and cotton.

Keywords kenaf； SSR primer； genetic diversity； universality

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.017

紅麻（Hibiscus cannabinus，2n=36），又稱作大槿麻、洋麻、鐘麻等，是世界上非常重要的一年生韌皮纖維作物，屬于錦葵科（Malvaceae）木槿屬二倍體植物[1]。紅麻韌皮纖維具有抑菌性強、透氣性高、吸濕性好、易染色、抗靜電、水分散失快、拉力強、降解性強等優良特性，在工業上，其纖維可用于生產汽車的內襯、輕型板材、手提袋、麻紡織、絨毛漿，而其莖干則用于生產麻炭及環境友好型的吸附材料，同時還可以轉化成乙醇、麻塑料，用于生產麻油，麻酵素等，是一種十分重要的工業原料作物。因此紅麻被稱為21世紀很有潛力的優勢作物[2-3]。

微衛星，又稱簡單序列重復（simple sequence repeats，SSRs），是當前運用較廣、比較理想的一種分子標記技術[4]，已經成功地應用于品種的鑒定、物種的分類比較及遺傳圖譜構建等研究[5]。但是，由于紅麻基因組尚未破譯，目前應用到紅麻中的SSR標記比較有限，這直接影響了紅麻的遺傳育種研究。因此，開發出新的SSR引物顯得十分重要。當前，獲得SSR引物的途徑主要有3種：一是在基因組文庫中進行篩選，如Mir等[6]開發黃麻SSR引物；二是在GenBank等數據庫和相關文獻中查詢，如黃麻EST-SSR引物開發[7]；三是從近緣物種中獲得已設計好的引物，如Satya等[8]探索棉花和黃麻的SSR引物在錦葵科22個不同屬的多態性。盡管課題組前期利用轉錄組測序數據，開發了11 083對HcEMS編號的SSR引物[9]和94對HcES編號的SSR引物[10]，但未探索紅麻與近緣物種的SSR通用性。物種間的SSR側翼序列相對保守，從某一物種中篩選出SSR引物用于其近緣種屬的擴增，是一種效率高、成本低、實用性強的獲取標記的途徑[8]。

紅麻與棉花同屬于錦葵科，兩者之間具有較好的共線性[9]。與棉花相比，紅麻的遺傳研究進展相對落后。利用棉花遺傳信息加強紅麻的遺傳育種研究，對于發現新基因、創造新種質、培育高產優質適應性強的紅麻品種具有重要意義。陸地棉已經開發出了大量的SSR引物[11]，其通用性也在非同源物種香蕉中得到了驗證[12]。武耀龍等[13]利用64對棉花引物在紅麻中初步進行了通用性的研究，但該實驗使用的棉花SSR引物和紅麻實驗材料偏少。本研究擬通過260對陸地棉SSR引物在24份紅麻基因組中的擴增情況來檢測棉花引物在紅麻中是否通用，評價多態性比例，一方面為紅麻提供更多的SSR標記，另一方面有助于紅麻與棉花的比較基因組學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

以24份不同原產地的紅麻種質資源為實驗材料，如表1所示，均由福建農林大學麻類遺傳育種與綜合利用實驗室提供。2016年5月1日種植于福建省三明市尤溪縣福建農林大學洋中科教基地。

1.2 方法

1.2.1 紅麻基因組DNA的提取 使用改良的CTAB法提取紅麻基因組DNA[14]，提取后的DNA進行濃度測定。當DNA濃度符合要求（OD260/ OD280在1.8～2.0）時，將提取的DNA用TE溶液稀釋到50 ng/μL，于–20 ℃保存，用于PCR的擴增。

1.2.2 SSR引物挑選 本研究從陸地棉每條染色體上隨機挑選10對SSR引物[11]，如附表1所示，共260對SSR引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增與PAGE電泳檢測 PCR體系為：2.0 μL DNA溶液（50 ng/L），0.5 μL 引物（forward+reverse），3.75 μL 2×Taq Master Mix（廈門泰京生物技術有限公司），3.75 μL ddH2O，組成10 μL的PCR體系，加10 μL液體石蠟油覆蓋，離心后混勻用于PCR。

PCR的程序為：95 ℃預變性3min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s（每個循環退火溫度降低0.5 ℃），72 ℃延伸45 s，一共10個循環；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

利用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測，其實驗方法參考萬雪貝等 [10]的方法。

1.3 數據的記錄與分析

根據分子量標準標記的片段大小估算擴增片段的大小。采用0和1的讀帶方法，有帶的記為“1”，無條帶的記為“0”。再利用NTSYSpc2.1e軟件對24份紅麻材料進行聚類分析，生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 棉花SSR引物在紅麻中的擴增結果統計

陸地棉共26條染色體，分成A基因組染色體（A1～ A13）和D基因組染色體（D1～ D13） 。每條染色體上選取10對引物，共260對棉花SSR引物。260對棉花SSR引物在24份紅麻種質資源進行擴增（附表1和圖1）。139對引物擴增出了條帶（比例為53.5%），表明通用性較好，總共獲得292條帶。片段大小變化在70～720 bp，每對引物擴增出來的條帶數變化在1～7條，平均每對引物擴增出2.1條帶。計算其PIC（多態信息量），最小值為0.079 9（RES_008），最大值為0.900 6（RES_247），平均多態信息量為0.541 9，說明了大部分棉花SSR引物在紅麻中具有較高的多態性，證實了棉花SSR引物應用于紅麻是可行的。

在比較SSR引物通用性的基礎上，進一步分析了其多態性。在139對棉花SSR引物擴增帶型中，128對在紅麻中表現出多態性，占所有引物的多態性比例為49.2%。從數據可以看出，棉花SSR引物在紅麻中多態性比率是較高的。可能的原因是棉花和紅麻屬于同科不同屬，具有一定的親緣關系，能夠形成良好的多態性。當然，不同引物擴增出來的多態性條帶數差異較大。其中，產生多態性條帶較多的引物是RES_45和RES_ 46、RES_244、RES_247，分別產生了7條和6條、6條、6條多態性條帶。

2.2 棉花不同染色體上的SSR引物在紅麻中的多態性分析

陸地棉各染色體的擴增及多態性情況如圖2所示。其中A基因組的13條染色體中共有71對SSR引物可以在紅麻中擴增出條帶，68對SSR引物表現出多態性，比率分別為54.6%和52.3%；D基因組的13條染色體中共有68對SSR引物可以在紅麻中擴增出條帶，60對SSR引物表現出多態性，比率分別為52.3%和46.2%。說明陸地棉A

基因組中的13條染色體上挑選出來的引物的擴增率及多態性略高于D基因組染色體。

在A基因組染色體中，染色體A1、A5上各有9對SSR引物在紅麻中擴增出來，表現出多態性的有9對，擴增率和多態率都達到90%；染色體A8上只有1對SSR引物被擴增出來，并表現出多態性，擴增率和多態率為10%。在D基因組染色體中，染色體D8上有10對SSR引物在紅麻中擴增出來，表現出多態性的有10對，擴增率和多態率都達到100%；染色體D11上只有2對SSR引物被擴增出來，表現出多態性的只有1對，擴增率和多態率分別為20%和10%。從數據可以看出，棉花不同染色體上的SSR引物的擴增率和多態率是不同的，A1、A5和D8染色體上SSR引物在紅麻的擴增率和多態率最高，而A8和D11最低。這些分析可以為紅麻更有針對性地挑選多態性高的棉花染色體上的SSR引物。

2.3 基于棉花SSR標記的紅麻種質遺傳多樣性分析

應用NTSYS軟件對24份紅麻種質進行聚類分析（圖3），遺傳相似系數最大的為0.87（80FH5和T19），而最小的為0.35。以遺傳相似系數0.58為閾值，可以把24份紅麻種質分成兩個類群，其中類群1（Pop1）有且只有AfricaLY，類群2（Pop2）包括其他23份紅麻種質。這說明AfricaLY這一種質同其他紅麻種質的親緣關系較遠，可以將AfricaLY同其他23份紅麻種質區分開來。進一步以遺傳相似系數0.64為閾值，可以把24份紅麻種質分成4個亞群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中類群Pop1只有一個亞群（Ⅰ），有且只有AfricaLY；而Pop2有3個亞群（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。其中，亞群Ⅱ有42KD3、K57SCS11061、K56taihongZ等18個種質，亞群Ⅲ有FH2、KG121和Zambia1共3個種質，亞群Ⅳ有ZHM16、7380共2個種質。24份紅麻種質中，18份紅麻種質在亞群Ⅱ中，表明亞群Ⅱ中的這些種質的親緣關系比較近，遺傳差異較小。

3 討論

利用260對棉花SSR引物在紅麻中進行擴增，其中有139對引物擴增出了條帶，比例為53.5%，但仍然有121對來自棉花基因組中的SSR引物還沒有被擴增出來，可能是因為這些SSR的基因位點屬于棉花所特有的。課題組前期利用紅麻轉錄組數據與棉花進行共線性分析，發現8.99%基因是雷蒙德氏棉花所特有的[9]。

簡單重復序列SSR具有操作簡便、高共顯性、高多態性等特點，但由于其擴增位點較少，開發成本高，所以研究物種之間SSR分子標記的通用性有利于提高引物的利用效率，降低引物的開發成本[15]。近幾年來，紅麻SSR分子標記的開發比較少，研究者只能利用隨機擴增多態性DNA標記， 如陶愛芬等[16]通過福紅2號等4份品種DNA為模板，篩選出了17對多態性較好的ISSR引物。很多研究表明，SSR引物在近緣物種以及一些遠緣物種中都具有良好的通用性。盧玉飛等[17]通過用382對玉米SSR引物和100對甘蔗EST-SSR引物在84份芒屬材料中進行通用性的實驗，其中多態性比例分別為10.21%和13.00%。唐鑫等[18]研究發現，1824對西瓜基因組SSR引物在有棱絲瓜、苦瓜、冬瓜中的多態性比例分別為3.84%、1.81%和0.44%。付飛等[19]利用204對玉米SSR引物在高粱中進行通用性分析，通用性比例和多態性比例分別為75%、27.9%。紅麻和棉花同屬于錦葵科不同屬的作物，本研究選取了260對棉花SSR引物對24份紅麻種質進行PCR擴增，其中139對引物擴增出了條帶，通用性比例達53.5%，128對引物具有多態性條帶，多態性比例達49.2%。本研究的通用性比例及多態性比例雖較武耀龍等[13]的89%和56%要低，但武耀龍等[13]的實驗僅有64對棉花引物，實驗所用到的引物基數偏少。本研究利用260對棉花SSR引物、24份紅麻材料，得到了更多的實驗數據，發現棉花不同染色體上的SSR引物的擴增率和多態率是不同的， 暗示著棉花和紅麻物種分化后，染色體存在重排現象。這些表明，棉花引物應用到紅麻分子標記研究中是可行的，也初步證實了近緣物種間SSR引物是可以通用的。

本研究通過NTSYS軟件進行聚類分析，以遺傳相似系數0.58為閾值，把24份紅麻種質分成2個類群，其中AfricaLY單獨一個類群（Pop1），其他的23個紅麻種質一個類群（Pop2）。從類群的劃分可以看出，非洲裂葉同其他23份紅麻種質之間存在著較大的遺傳差異，而這種差異是因為非洲裂葉來源于非洲，其地理來源同其他種質都有較大的差異。而在亞群劃分上，AfricaLY單獨劃分為亞群Ⅰ；亞群Ⅱ共包含18份種質，其中有17份種質產地都處于北緯0°～30°，親緣關系最近的是T19和福紅5號。德國的SCS-11-06-1雖然也被劃分在亞群Ⅱ內，但聚類圖中顯示其與KD3-2、Taihong-2和722-3親緣關系稍近，跟亞群Ⅱ其他種質親緣關系仍然較遠。亞群Ⅲ包含來自贊比亞的Zanyin No. 1，而福紅952劃分在亞群Ⅱ內，這說明Zanyin No. 1和福紅952能被被區分開來。從其地理來源來看， Zanyin No. 1是在低緯度國家贊比亞選育而成的，而福紅952是在亞熱帶地區福建省選育而成的，所以兩者之間存在較大的差異。課題組前期[20]進行的紅麻光周期反應敏感度的實驗表明，福紅952光周期反應敏感度為56.2%，Zanyin No.1光周期反應敏感度為36.0%，進一步證實了這2份種質之間存在著較大差異。

本研究通過棉花SSR分析24份紅麻種質的遺傳多樣性，遺傳相似系數變化為0.35～0.87，與前人研究相比，如陶愛芬等[16]通過ISSR對30份紅麻種質進行分析得到的遺傳相似系數0.70～0.95，以及鄭海燕等[21]通過SRAP對51份紅麻種質進行分析得到的遺傳相似系數0.62～0.99，這24份紅麻種質資源之間的遺傳距離較大，親緣關系較遠。這些體現出，棉花SSR引物對紅麻進行遺傳多樣性分析是可行的，這不僅豐富了紅麻的SSR分子標記，而且為紅麻和棉屬的比較基因組學和遺傳研究提供了依據。

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