MeJA和ET對巴西橡膠樹膠乳HbGSK1基因表達的影響

楊署光 張世鑫 吳紹華 陳月異 李言 史敏晶 田維敏

中國熱帶農業科學院橡膠研究所/農業部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南儋州 571737

摘 要 GSK3蛋白與進化過程中的激素信號網絡和生物、非生物脅迫響應密切關聯。GSK3是否在橡膠樹JA和ET信號途徑起作用尚不清楚。qPCR分析結果表明，機械傷害、MeJA和ET處理上調膠乳中HbGSK1基因的表達，并且“機械傷害+MeJA”處理的表達水平顯著高于機械傷害處理，推測機械傷害通過上調膠乳內源JA含量上調HbGSK1基因的表達；機械傷害上調膠乳中HbGSK1基因的表達，表明HbGSK1蛋白可能參與橡膠樹非生物脅迫響應；MeJA和ET處理上調膠乳中HbGSK1基因的表達，表明HbGSK1蛋白可能參與橡膠樹JA和ET植物激素信號途徑的調節。MeJA和ET處理均上調膠乳中HbGSK1基因的表達，表明JA和ET對HbGSK1基因的表達的調節具有協同作用。

關鍵詞 茉莉酸甲酯；乙烯；巴西橡膠樹；HbGSK1；表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Effects of Exogenous Jasmonates and Ethylene on the Expression of HbGSK1 in the Latex of Hevea brasiliensis Müll. Arg.

YANG Shuguang， ZHANG Shixin， WU Shaohua， CHEN Yueyi， LI Yan， SHI Minjing， TIAN Weimin*

Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Rubber Biology， Minstry of Agriculture /State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Recent studies have revealed that plant GSK3 proteins are actively implicated in hormonal signalling networks during development as well as in biotic and abiotic stress responses. Whether GSK in rubber trees functions in jasmonates and ethylene signaling is unknown. In this study， a real-time PCR analysis showed that the expression of HbGSK1 was upregulated by mcchanical wounding， methy jasmonates and ethylene. Moreover， the influence on HbGSK1 expression of “wounging+methy jasmonates” was greater than that of wounding， suggesting that wounding upregulates the expression of HbGSK1 by facilitates the biosynthesis of endogenesis jasmonates. The change of HbGSK1 transcript levels in latex indicated that HbGSK1 protein was involved in abiotic stress responses as well as in jasmonates and ethylene signaling of rubber trees. In addition， JA and ET operate synergistically in regulating HbGSK1 expression.

Key words methy jasmonates； ethylene； Hevea brasiliensis Müll. Arg.； HbGSK1； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.012

植物GSK3（糖原合成酶激酶3）蛋白與進化過程中的激素信號網絡和生物、非生物脅迫響應密切關聯。在擬南芥中，AtSK12[1-2]、AtSK21[3-10]、AtSK22[5， 11]、AtSK23[5， 11]、AtSK32[12]調節BR信號傳導，AtSK21[13-14]調節ABA信號傳導，AtSK21[15-16]、AtSK31[17]調節生長素信號傳導，AtSK21介導BR-ABA[14， 18]、BR-Auxin[15]、BR-GA[10]信號途徑的交叉傳導；在水稻中，OsSK21[19-20]、OsSK24[20]、OsSK22[21]調節BR信號傳導。

目前，模式植物擬南芥和水稻的GSK3s報道最多，其中，GSK3s調節激素信號途徑的研究以BR信號途徑最多，其次是生長素和脫落酸信號途徑，GSK3s調節JA（茉莉酸）和ET（乙烯）信號途徑的研究尚未見報道。在大戟科植物中，最近報道了ABA處理上調小桐子GSK3 JcGSK基因的表達[22]。

中國橡膠樹植膠區位于北緯18～24曘的熱帶北緣和南亞熱帶地區，寒潮、臺風和干旱是最為嚴重的自然災害。因此，選育抗逆高產的橡膠樹無性系是中國橡膠樹育種的重要目標。在抗逆相關基因的研究基礎上開發抗逆相關分子標記來輔助育種，將大幅提高抗逆性鑒定效率，推進抗逆品種的選育進程。JA和ET是橡膠樹割膠過程中產生的2種重要的植物激素。在前期研究中，筆者們從膠乳中克隆到一個橡膠樹GSK3基因HbGSK1（GenBank：JN835185.1），本研究分析MeJA和ET處理對膠乳中HbGSK1基因表達的影響，為進一步探討橡膠樹抗逆機理、開發抗逆分子標記、輔助橡膠樹抗逆育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Müll.Arg.）無性系CATAS7-33-97，種植于中國熱帶農業科學院試驗場。DNaseⅠ購自天根公司，反轉錄試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自Ferments公司，實時熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）購自大連寶生物公司，其它生化試劑均為進口或國產分析純試劑。引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 選取大小、長勢、物候期基本一致的成齡巴西橡膠樹無性系CATAS7-33-97的未開割樹和1年生橡膠樹穩定期萌條開展實驗。

（1）機械傷害和MeJA處理成齡未開割樹：以成齡未開割樹為材料，用刀片刮傷至皮層（2 cm×2 cm），對照涂上7.14%乙醇溶液：羊毛脂（1：1，V/m）的混合羊毛脂；處理涂上含0.14% MeJA的混合羊毛脂：含0.14% MeJA用7.14%乙醇溶解并混勻，分別在處理后0 h、6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d采樣，針刺采膠，每個處理收集5株的混合樣，用于提取膠乳總RNA。

（2）MeJA處理1年生橡膠樹穩定期萌條：以1年生橡膠樹穩定期萌條為材料，處理頂蓬節間，對照用7.14%的乙醇溶液處理，處理用含0.07% MeJA的7.14%乙醇溶液處理，分別在處理后2、6 h及1、3、5 d采樣，用刀片切割韌皮部采膠，每個處理收集5株的混合樣，用于提取膠乳總RNA。

（3）ET處理1年生橡膠樹穩定期萌條：以1年生橡膠樹穩定期萌條為材料，用0.05% ET處理頂蓬節間，對照不作任何處理，分別在處理后2 h、6 h、1 d、3 d、5 d采樣，用刀片切割韌皮部采膠，每個處理收集5株的混合樣，用于提取膠乳總RNA。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成 膠乳總RNA提取參照曾日中等[23]的方法。cDNA第一鏈的合成參照反轉錄試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit的說明書進行。

1.2.3 生物信息學分析 利用DNAMAN軟件對HbGSK1蛋白序列進行比對分析；從NCBI數據庫下載擬南芥和水稻的GSK3s蛋白序列，首先用ClustalW進行序列多重比對，再利用MEGA4.0軟件，選擇neighbour -joining（NJ）模型，并進行1 000次bootstrap統計學檢驗，構建包括HbGSK1蛋白序列在內的植物GSK3蛋白的系統進化樹；利用Prosite在線數據庫分析蛋白的功能位點；利用NetPhos2.0 Server在線軟件分析蛋白的磷酸化位點。

1.2.4 熒光定量PCR分析 根據獲得的HbGSK1 cDNA全長序列設計qPCR引物（F：GAGTAGTATTCCAGGCTAAGTG，R：TAGTTTGCAGCTCACGGTTCTT），以Hb18S（F：GCTCGAAGACGATCAGATACC，R：TTCAGCCTTGCGACCATAC）作為內參基因，分析HbGSK1的基因表達。取1 μg膠乳總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈，稀釋10倍后作為熒光定量PCR分析的模板。qPCR反應體系為20 μL，其中2x SYBR Premix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物濃度為10 μmol/L，反應體系中每條引物終濃度均為0.2 μmol/L）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反應在Bio-Rad公司的CFX實時熒光定量PCR儀中進行，實驗操作按儀器使用說明書進行，qPCR反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環；40個循環后進行溶解曲線分析。利用CFXmanager 3.0軟件自動進行基線和Cq值分析。

1.3 數據處理

用Excel 2003作圖，用SPSS軟件的R-E-G-WQ（Q）檢驗進行多重比較分析：標有不同大寫字母者表示組間差異極顯著（p<0.01），標有不同小寫字母者表示組間差異顯著（p<0.05），而標有相同小寫字母者表示組間差異不顯著（p>0.05）。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）進行成對比較分析：p<0.01表示組間差異極顯著，p<0.05表示組間差異顯著。根據Q=2△Cq=2min Cq-Sample Cq計算基因的表達值。

2 結果與分析

2.1 HbGSK1蛋白功能位點分析

NetPhos 2.0 Server磷酸化位分析結果發現，HbGSK1蛋白共有56個可能的磷酸化位點[17個絲氨酸（Serine）位點、24個蘇氨酸（Threonine）位點和15個酪氨酸（Tyrosine）位點]，其中13個磷酸化位點的預測得分大于0.500，包括5個絲氨酸位點（Ser：10、135、232、278、364，Score分別為0.845、0.901、0.861、0.843、0.819），4個蘇氨酸位點（Thr：43、117、137、347，Score分別為0.799、0.831、0.949、0.705），4個酪氨酸位點（Tyr：110、143、233、305，Score分別為0.520、0.957、0.710、0.835）（見表1）。Prosite分析結果發現，HbGSK1蛋白序列含有5類功能位點：包括1個酪氨酸激酶磷酸化位點（tyrosine kinase phosphorylation site）：Tyr110，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（casein kinase II phosphorylation site）：Ser135/278、Thr43/137/253/294/347，5個蛋白激酶C磷酸化位點（Protein kinase C phosphorylationsite）：Ser128/220/364、Thr117/137，4個豆蔻?；稽c（N-myristoylation site）和3個N-糖基化位點（N-glycosylation site）（表1）。

2.2 氨基酸序列比對及進化樹構建

由表2可知，擬南芥和水稻的GSK3s蛋白分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四種類型，推導的HbGSK1氨基酸序列與擬南芥和水稻的GSK3s蛋白序列構建系統進化樹顯示，橡膠樹HbGSK1與擬南芥（AtSK11、AtSK12、AtSK13）和水稻（OsSK11、OsSK12、OsSK13）的亞組Ⅰ聚為一類，親緣關系最近（圖1）。

人類hGSK3β分別與擬南芥GSK3代表AtSK21/BIN2和橡膠樹GSK3 HbGSK1的比對結果顯示，HbGSK1蛋白序列與hGSK3β和AtSK21/BIN2蛋白的序列相似性分別為56.26%、72.59%，并且STKc激酶結構域和關鍵的活性調節位點高度保守，說明該基因在物種進化過程中高度保守。如圖2所示，黑下劃線（_）表示STKc激酶結構域（hGSK3β：56-344；HbGSK1：73-357，AtSK21/BIN2：40-328）；虛下劃線（﹍）表示植物中保守的TREE結構域（HbGSK1：294-297；AtSK21/BIN2：261-264），點突變處理擬南芥時TREE結構域第一、三、四位殘基引起AtSK21/BIN2功能獲得性點突變等位基因[bin2-1和dwf12-2D（E263K）；bin2-2（T261I）；ucu1-1，ucu1-2和dwf12-1D（E264K）][24-26]；保守的酪氨酸殘基（hGSK3β：Y216；AtSK21/BIN2：Y200；HbGSK1：Y233）用白箭頭（▽）表示，其磷酸化對激酶活性是必需的；保守的磷酸鹽結合殘基（hGSK3β：Arg96、Arg180、Lys205；AtSK21/BIN2：Arg80、Arg164、Lys189；HbGSK1：Arg113、Arg197、Lys222）用星號（*）表示，它與初始磷酸化底物結合；擬南芥弱等位基因ucu1-3（P284S）用加號（⊕）表示；其他功能散失突變[11]用分界符表（§）示（G49D，C183Y，R312K；所有殘基在hGSK3β中都是保守的）；死激酶突變bin2（K69R）用磅字符（﹟）表示，該突變抑制功能獲得性突變；hGSK3β特異的Ser9（hGSK3β：Ser9；HbGSK1：Ser10）用黑色箭頭（▼）表示，該殘基對hGSK3β的抑制調節是必需的。

2.3 HbGSK1基因表達與分析

以18S基因為內參，qRT-PCR分析HbGSK1在巴西橡膠樹膠乳中的基因表達情況。

2.3.1 機械傷害和茉莉酸甲酯（MeJA）上調次生膠乳中HbGSK1基因的表達 由圖3可知，機械傷害處理6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d的基因表達水平分別是處理0 h的5.50、11.45、15.95、26.49、2.74、1.85倍，處理3 d表達水平最高，7 d后恢復到未處理水平（p>0.05）；MeJA處理6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d的基因表達水平分別是處理0 h的3.46、8.74、16.92、52.68、5.81、3.76倍，處理3 d表達水平最高，7 d后恢復到較低水平；處理后2 d以內（0 h、6 h、1 d、2 d），機械傷害和MeJA處理的基因表達水平差異不顯著，處理超過2 d（3 d、7 d、15 d），MeJA處理的基因表達水平顯著高于（p<0.01）機械傷害處理，表明外源MeJA在處理2 d后才進入植物體內發揮作用，并且MeJA處理短暫而大幅度上調次生膠乳中HbGSK1基因的表達。機械傷害和MeJA處理上調膠乳中HbGSK1基因的表達，并且“機械傷害+MeJA”處理的表達水平顯著高于機械傷害處理，推測機械傷害通過上調膠乳內源JA含量而上調HbGSK1基因的表達，表明HbGSK1可能參與橡膠樹非生物脅迫和JA信號途徑的調節。

CK：傷害+羊毛脂；MeJA：傷害+含0.14% MeJA的羊毛脂；不同大寫字母表示組間差異極顯著（p<0.01）。下同。

CK： wounding + lanolin； JA： 0.14% MeJA + lanolin； The different capital letters indicate significance at T<0.01 level. The same as below.

2.3.2 茉莉酸甲酯（MeJA）上調初生膠乳中HbGSK1基因的表達 由圖4可知，MeJA處理2 h、6 h、1 d、3 d、5 d的基因表達水平分別是對照的1.39、0.55、3.13、1.32、1.20倍（圖4-B），處理1 d的表達水平最高；雖然2 h、6 h、3 d、5 d處理與對照間差異顯著（p<0.01或p<0.05），但處理和對照的基因表達水平基本在0.5～1.0之間波動（圖4-A），基因表達變化幅度也只有±0.5倍左右（圖4-B）。TTEST分析結果表明，對照組（CK：2 h、6 h、3 d、5 d）與處理組（JA：2 h、6 h、3 d、5 d）表達水平間差異不顯著（p>0.05）。MeJA處理短暫而大幅度上調初生膠乳中HbGSK1基因的表達，表明HbGSK1可能參與橡膠樹JA信號途徑的調節。

2.3.3 乙烯（ET）上調初生膠乳中HbGSK1基因的表達 由圖5可知，ET處理2 h、6 h、1 d、3 d、5 d的基因表達水平分別是對照的1.36、8.14、7.73、1.80、9.01倍（圖5-B），其中處理5 d表達水平最高；HbGSK1基因的表達對ET處理敏感，處理后6 h的基因表達就大幅度上調，并一直維持在較高的水平（圖5-A）；異常的是，處理后3 d的樣品，雖然基因表達依然高于對照，但與前后時間點相比上調幅度大副減小，推測在大田處理過程中，這個時間點的樣品受到其它環境因子的干擾，而這些環境因子恰巧又能影響HbGSK1基因的表達。ET處理上調初生膠乳中HbGSK1基因的表達，表明HbGSK1可能參與橡膠樹ET信號途徑的調節。

3 討論

植物激素是脅迫響應的監視者[27]。除了在個體水平發揮關鍵作用，不同植物激素也交叉傳導，以促進參與脅迫修復的任何一組基因或它們的調節因子的協調[28]。植物GSK3蛋白與進化過程中的激素信號網絡和生物、非生物脅迫響應密切關聯。在擬南芥中，AtSK12[1，2]、AtSK21[3-10]、AtSK22[5，11]、AtSK23[5，11]、AtSK32[12]調節BR信號傳導，AtSK21[13，29]調節ABA信號傳導，AtSK21[15，16]、AtSK31[17]調節生長素信號傳導，AtSK21介導BR-ABA[14，18]、BR-Auxin[15]、BR-GA[10]信號途徑的交叉傳導；在水稻中，OsSK21[19，20]、OsSK24[20]、OsSK22[21]調節BR信號傳導。

已有研究結果表明，葉片損傷后紫花苜蓿GSK3蛋白WIN（Wound-induced Gene）的激酶活性被瞬時觸發[30]，傷害后擬南芥AtSKs的基因表達有一定幅度的變化[31]。機械損傷處理上調小桐子幼苗JcGSK基因的表達[22]。本研究獲得相似的結果，機械傷害上調橡膠樹膠乳中HbGSK1的基因表達。MeJA減小而BR增加水稻葉片角，MeJA處理降低了BR信號轉導及其目的基因的mRNA水平，表明MeJA抑制葉片角可能依賴于BR生物合成和BR信號轉導途徑，GSK3類激酶（BR信號轉導的一個抑制因子）的LiCL誘導失活部分挽救了MeJA誘導的葉片角減小，暗示GSK3可能參與MeJA信號途徑的調節[32]。在本研究中，MeJA上調橡膠樹膠乳中HbGSK1基因的表達，表明HbGSK1參與JA信號途徑的調節。JA和ET在調節防衛相關基因中協同運作[33-35]。本研究結果表明，MeJA和ET處理均上調橡膠樹膠乳中HbGSK1基因的表達，表明HbGSK1參與MeJA和ET信號途徑的調節，并且MeJA和ET協同誘導HbGSK1基因的表達。

4 結論

機械傷害和MeJA處理上調膠乳中HbGSK1基因的表達，并且“機械傷害+MeJA”處理的表達水平顯著高于機械傷害處理，推測機械傷害通過上調膠乳內源JA含量而上調HbGSK1基因的表達；機械傷害上調膠乳中HbGSK1基因的表達，表明HbGSK1可能參與橡膠樹非生物脅迫響應；MeJA和ET處理上調膠乳中HbGSK1基因的表達，表明HbGSK1可能參與橡膠樹JA和ET信號途徑的調節。MeJA和ET處理均上調膠乳中HbGSK1基因的表達，表明JA和ET對HbGSK1基因的表達調節具有協同作用。

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