銀龍魚爛鰓病病原的分離和鑒定

史謝堯 賈文平 郝爽 張振國 羅璋 周文禮 馮守明

摘要 [目的]對患爛鰓病銀龍魚開展病原分離和鑒定。[方法]采用人工回歸感染試驗確定分離菌株的致病性，利用生理生化試驗和16S rDNA 基因序列分析對病原菌進行鑒定。[結果]分離菌株YY-2017-3對斑馬魚具有致病性，其生理生化試驗結果與柱狀黃桿菌相一致；YY-2017-3菌株的16S rDNA基因序列與柱狀黃桿菌聚為一支，對多種藥物顯示耐藥。[結論]菌株YY-2017-3被鑒定為柱狀黃桿菌，這是柱狀黃桿菌引起銀龍魚爛鰓病在國內的首次報道。

關鍵詞 銀龍魚；爛鰓病；病原菌；柱狀黃桿菌

中圖分類號 S941.42+4文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）15-0075-04

Abstract [Objective] To make the isolation and identification of pathogen from Osteoglossum bicirrhosum with gill rot disease.[Method] The pathogenicity of isolated strain was confirmed by artificial infection test，and the isolated strain was identified through physiological and biochemical tests，16S rDNA gene sequencing results.[Result] The isolated strain YY-2017-3 was pathogenic to zebra fish，and its physiological and biochemical properties were consistent with those of Flavobacterium columnare.YY-2017-3 strain formed a single cluster with 16S rDNA gene sequences of F.columnare，and it showed resistant to many kinds of antibiotics.[Conclusion]YY-2017-3 strain was identified as F.columnare.It was the first report about this bacterium caused gill roll disease of F.columnare in China.

Key words Osteoglossum bicirrhosum；Gill rot disease；Pathogen；Flavobacterium columnare

龍魚是一類古老的大型淡水魚，因其體形酷似我國神話中的龍，故俗稱龍魚，在分類上屬于輻鰭魚綱骨舌魚目骨舌魚科。龍魚是地球上比較原始的魚類，早在距今3億多年前的遠古石炭紀就已經存在，素有“活化石”之稱[1]。目前，人工養殖的龍魚品種主要有金龍魚、銀龍魚和紅龍魚，其中以銀龍魚養殖數量和市場銷量最大。銀龍魚鱗片較大，受光線照射時鱗片反射出銀白色光輝，具有較高的觀賞價值，深受觀賞魚愛好者喜愛，是一種名貴觀賞魚[2-3]。

近年來，隨著養殖技術的不斷發展，銀龍魚的人工培育和養殖技術逐步完善，廣東、河北、天津等地養殖企業已開展銀龍魚苗的規模化培育并取得成功。2017年3月中旬，天津市寧河區某銀龍魚養殖場發生病害，患病銀龍魚體色暗淡無光澤，厭食，聚集于水體表層，對外界反應遲鈍。筆者對患病銀龍魚進行了病原分離與鑒定，并對其進行了藥敏試驗，旨在為銀龍魚疾病的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 患病銀龍魚（體長8.2～10.3 cm）來自天津市寧河區某觀賞魚養殖場；健康斑馬魚（體長3.2～4.1 cm）購自天津市中環觀賞魚市場。

Shieh培養基參照文獻[4]的方法配制；微生物生化管和藥敏片由杭州天和微生物試劑有限公司生產；LB培養基購自北京陸橋生物技術股份有限責任公司；PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；rTaq、pMD 19T Vector，DNA Marker和Gel Extraction kit均購自TaKaRa公司。

1.2 病原的分離和寄生蟲檢查

用75%乙醇浸過的棉球對患病銀龍魚進行反復擦拭后，在無菌條件下對病魚進行解剖，用接種環從患病魚的鰓組織取少量樣品劃線接種于Shieh平板和LB平板，另外從肝、脾、腎等組織劃線接種于LB平板和BHI平板；28 ℃培育48 h后，選取優勢菌落進行進一步純化，直至獲得純培養菌株。取患病銀龍魚的鰓絲、鰭條、體表黏液、腸道黏液、血液、肝臟、脾臟和腎臟等樣品在顯微鏡下進行寄生蟲檢查。

1.3 病原的鑒定

1.3.1 生理生化試驗。

將分離純化后的YY-2017-3菌株劃線接種于Shieh平板，28 ℃培養48 h后，觀察其菌落形態。生理生化試驗按參考文獻[5-7]的方法進行。生理生化試驗測定項目包括葡萄糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、鳥氨酸脫羧、精氨酸脫羧、賴氨酸脫羧、精氨酸水解、尿素、甘露醇、硫化氫、硝酸鹽還原、枸椽酸鹽、靛基質、七葉苷、明膠、觸酶、氧化酶。

1.3.2 分子生物學鑒定。

參照文獻[8]的方法進行分子生物學鑒定，以提取菌株YY-2017-3的基因組DNA為模板，采用細菌16S rDNA序列擴增的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGCTT-3′）進行PCR擴增。PCR反應體系為：模板2 μL，上下游引物各0.4 μL（濃度10 μmol/L），2 × Mix 20 μL，補雙蒸水至40 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。將PCR產物切膠回收，連接pMD-19T載體后，轉E.coil TOP10感受態細胞，挑取陽性克隆進行測序。將測序結果與已登錄GenBank數據庫的序列進行同源性比對后，從GenBank數據庫中下載相近種的16S rDNA序列，利用MEGA5.0軟件進行多序列匹配排列，采用鄰位相連法（Neighbor-joining） 構建系統發育樹。

1.4 藥敏試驗 參照文獻[9]的方法進行藥敏試驗，將YY-2017-3菌株接種在Shieh培養基中，在28 ℃、150 r/min培養48 h后，6 000 r/min離心集菌10 min，用無菌PBS將菌液濃度調整至1× 108 CFU/mL，取200 μL菌懸液均勻涂布于Shieh平板后，貼上藥敏紙片，28 ℃培養48 h后，觀察并記錄抑菌圈直徑，根據藥敏紙片說明書的判定標準進行判定。

1.5 人工回歸感染斑馬魚試驗 將60尾健康斑馬魚（體長3.2～4.1 cm）隨機分成2組，分別為感染組和對照組。將水溫調節至28 ℃，24 h不間斷曝氣，暫養14 d后開始試驗。感染組采用新鮮活化的YY-2017-3菌液浸泡感染，菌液終濃度為1.0 × 107 CFU/mL；浸泡1 h后，將斑馬魚撈出放回水族缸中飼養，對照組添加等量的Shieh培養基模擬浸泡感染。試驗期間不喂食、不換水，觀察感染后斑馬魚的活動情況，記錄死亡魚數量，及時撈走死魚。對瀕死的斑馬魚進行解剖，取鰓部組織在Shieh平板劃線，根據科赫原則鑒定是否能再次分離到相同的細菌。

2 結果與分析

2.1 發病魚癥狀

患病銀龍魚厭食、游泳異常、離群獨游并常浮于水體表層，呈缺氧狀態；體色暗淡、無光澤，鰓絲發白和部分腐爛。取少量鰓絲置于顯微鏡下觀察，發現大量桿狀細菌呈滑行運動。打開腹腔后，未發現內臟異常。

2.2 病原菌的分離和形態學觀察

從患病銀龍魚的肝、脾、腎等組織中未分離到細菌，但從鰓部分離到1株細菌，暫定名為YY-2017-3。該菌株在Shieh平板上形成大小不一、邊緣不整齊、假根狀、中央較厚、干燥、淡黃色的菌落（圖1）。

2.3 病原菌的鑒定

通過革蘭氏染色，利用光學顯微鏡觀察發現YY-2017-3菌株為革蘭氏陰性桿菌，有時彎曲成半圓形，無芽胞（圖2）。取菌懸液在顯微鏡下觀察，發現其運動方式為滑行。生理生化試驗結果表明，菌株YY-2017-3在尿素、硝酸鹽還原、觸酶、氧化酶、分解明膠反應中表現為陽性，其他均為陰性（表1）。

以YY-2017-3菌株的總DNA為模板，對其16S rDNA基因進行PCR擴增，得到 1 477 bp的核酸片段，完成測序后將序列在NCBI網站上進行同源性比對，發現其與Flavobacterium columnare strain CF2同源性最高，達99%。選用GenBank中已登錄的部分黃桿菌屬細菌的16S rDNA基因序列進行匹配排列，構建系統發育樹，結果發現YY-2017-3菌株與柱狀黃桿菌聚成一支（圖3）。綜合生理生化試驗和分子生物學鑒定結果，可將YY-2017-3菌株鑒定為柱狀黃桿菌。

46卷15期 史謝堯等 銀龍魚爛鰓病病原的分離和鑒定

2.4 回歸感染試驗 試驗組30尾斑馬魚在感染第3天開始死亡，在感染后的7 d內全部死亡。對照組斑馬魚沒有出現任何病癥。人工感染后試驗魚表現為反應遲鈍、離群獨游、體色發黑。對瀕死魚進行解剖檢查，發現斑馬魚鰓絲發白。從感染后的病魚鰓部中再次分離致病菌，進行生理生化試驗，其結果與菌株YY-2017-3相一致。

2.5 藥敏試驗

由表2可知，在測定的16種抗生素中，菌株YY-2017-3除對氨芐青霉素和羅紅霉素敏感外，對其他抗生素均顯示出耐藥或中度敏感。

3 結論與討論

柱狀黃桿菌是較早被發現和研究的魚類病原之一，早在1922年Davis[10]就從患病細口鱸魚（Micropterus dolomieui）和河鱸（Perca fluviatilis）中首次分離到該菌，并將其名為柱狀芽孢桿菌（Bacillus columnaris）。1944年，該菌被Ordal等[11]從患病紅鮭魚（Oncorhynchus nerka）體內分離，并被命名為柱形粒球黏細菌（Chondrococcus columnaris）。1945年，Garnjobst[12]從牛頭魚（Ameiurus nebulosus）體表病灶分離到該菌，發現其形態特征與柱形粒球黏細菌相似，但在產子實體方面存在差異，將其命名為柱狀噬纖維菌（Cytophaga columnaris）。盧全章等[13]于1975年從患爛鰓病的草魚體內分離到柱狀黃桿菌G4株，并將其命名為魚害黏球菌（Myxococcus piscicola）。 隨著細菌分類學研究的深入，對該菌的命名幾經更改。1996年，Bernardet等[14]利用16S rDNA基因序列構建系統發育樹，并結合生理生化特性進行綜合判斷，將其定名為柱狀黃桿菌。曾用名有柱狀粒球黏細菌、魚害黏球菌、柱狀噬纖維菌和柱狀屈撓桿菌（Flexibacter columnaris），都是柱狀黃桿菌的同物異名[7，14]。綜上可知，對柱狀黃桿菌的鑒定和命名，一直存在較大的爭議。隨著分子生物學的發展，細菌分類鑒定從傳統的表型分類進入基因型分類水平。一般認為，16S rDNA同源性大于97.5%的菌株可視為同種[15]。為了對從銀龍魚體內分離的細菌進行鑒定，該研究采用分子生物學鑒定和生理生化試驗相結合的方法。結果表明，分離菌株YY-2017-3的16S rDNA基因序列與柱狀黃桿菌的同源性達到99%，并聚為一支，且生理生化特性與其他研究結果[6-7]相一致。綜合考慮，可將分離菌株YY-2017-3鑒定為柱狀黃桿菌。

柱狀黃桿菌是一種常見的水產動物病原菌，其引發的柱形病又稱之為細菌性爛鰓，病給我國水產養殖業造成巨大的經濟損失[16-17]。柱狀黃桿菌宿主極為廣泛，草魚、鱖、鯉、鯽等淡水魚類都為易感品種，此外，也有從淡水觀賞魚中分離到該菌的報道[18]。筆者首次從銀龍魚中分離到柱狀黃桿菌，藥敏試驗結果表明分離菌株對測定的16種藥物中只有2種顯示為敏感，這與其他研究結果[6，18]差別較大。盡管在不同的水域環境中同種細菌的藥物敏感性可能存在差異，但該研究結果表明從銀龍魚中分離的柱狀黃桿菌菌株對12種藥物顯示為耐藥，且這些藥物中部分藥物為人用藥物。由于銀龍魚價格昂貴，養殖戶為了提高其存活率，可能存在頻繁使用藥物或濫用藥物的情況，從而導致了菌株耐藥性的提高。

為了有效防治柱狀黃桿菌引發的疾病，國內外學者開展了廣泛研究。陳昌福等[19]制備了柱狀黃桿菌注射疫苗，該疫苗表現出較好的免疫效果，但由于注射免疫操作煩瑣，限制了其廣泛應用。2011年，美國農業部研制出柱狀黃桿菌的減毒疫苗，通過浸泡免疫可獲得較好的免疫保護效果[20]，但減毒疫苗的安全性問題一直存在較大的爭議。王良發等[7]研究表明柱狀黃桿菌至少存在3種基因型，不同基因型的柱狀黃桿菌疫苗之間是否存在交叉免疫保護尚未確定。我國不同地區柱狀黃桿菌的血清型可能存在地域差異。因此，對于高檔魚類，使用本地區分離的病原菌制備成“自家疫苗”進行注射免疫接種應成為今后發展的趨勢。

筆者首次從銀龍魚中分離到柱狀黃桿菌，擴大了柱狀黃桿菌的宿主范圍，也為柱狀黃桿菌的進化分析、疫苗制備奠定了基礎。該研究發現分離株YY-2017-3對多種藥物顯示耐藥，但其耐藥機制尚有待于進一步研究。

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