鋁脅迫下不同耐性的小黑麥及其異源親本活性氧代謝研究

張濤 李強 陳教云 董登峰

摘要 [目的]將耐鋁的黑麥（389和390）與不耐鋁的四倍體小麥（5020）遠源雜交獲得耐鋁的小黑麥（5020×389 和5020×390），比較鋁脅迫下小黑麥及其異源親本活性氧代謝。[方法]通過水培及Al 脅迫處理，檢測不同處理時間小黑麥及其親本的膜穩定性、活性氧含量及代謝。[結果]AlCl3 處理后5020、5020×389 和5020×390 的MDA含量與質膜透性顯著增加，鋁處理2和12 d，與無鋁處理相比增幅為57.7%、11.1%、10.8% 和22.8%、17.4%、2.2%。Al促進5020、5020×389 和5020×390 活性氧含量的顯著提高，鋁處理2 d 時，H2O2 含量分別增加了63.2%、47.1%、37%，O2- 產生速率分別增加了63.2%、41.1%、37%，且在鋁處理12 d時，只有5020活性氧顯著增加。5020、5020×389和5020×390的SOD 活性在鋁處理2 和12 d時分別增加了74.5%、63.2%、61.7% 和45.1%、31.4%、20.1%。Al處理12 d時，與對照相比5020除了CAT外APX、GPX、GR活性均減小顯著減小了74.1%、69%、18%；5020×389和5020×390葉中APX、GPX、GR活性增加顯著分別增加了3.56倍、9.54倍與2.96倍、1.22倍與2.4倍、5.74倍。5020、5020×389和5020×390的GSH含量和GSSH含量均在鋁處理12 d顯著增加分別增加了54.0%、118.2% 和25.3%、18.0% 和22.0%、12.3%。[結論]小黑麥5020×389 和5020×390 表現為耐鋁，且耐鋁性5020×390稍強于5020×389。同時，研究表明不同耐鋁品種間葉中APX、GPX和GR活性差異是小黑麥及其異源親本耐鋁性差異顯著的原因之一。APX與GPX可能是5020×390耐鋁的主要作用酶，GR可能是5020×389耐鋁的主要作用酶。

關鍵詞 小黑； 遠源雜交； 鋁毒； 活性氧

中圖分類號 S501文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）15-0039-05

Abstract [Objective]Aluminum-tolerant triticale （ 5020×389 and 5020×390） were obtained from the aluminum-resistant rye （ 389 and 390） and aluminum-deficient tetraploid wheat （ 5020 ），and to compare the triticale and its heterologous parents active oxygen metabolism under aluminum stress.[Method]The membrane stability，active oxygen content and metabolism of triticale and its parents in different treatment time were detected by hydroponics and Al stress treatment.[Result]The contents of MDA and plasma membrane permeability of 5020，5020×389 and 5020×390 were significantly increased after AlCl3 treatment.The contents of MDA and membrane permeability of Al treatments were significantly increased after treatment with AlCl3 for 2 and 12 d （ 57.7%，11.1%，10.8% and 22.8%，17.4%，2.2%），respectively.Al promoted the content of active oxygen in 5020，5020×389 and 5020×390，and the contents of H2O2 increased by 63.2%，47.1%，37% and 63.2%，41.1%，37%，respectively，and only 5020 reactive oxygen species increased significantly after 12 days of aluminum treatment.The activities of SOD at 5020，5020×389 and 5020×390 increased by 74.5%，63.2%，61.7% and 45.1%，31.4%，20.1% at 2 d and 12 d，respectively.After Al treatment for 12 days，the activities of APX，GPX，and GR in 5020 except CAT were significantly reduced by 74.1%，69%，and 18%，respectively，compared to the control.The activities of APX，GPX，and GR in 5020×389 and 5020×390 leaves were significantly reduced.The increase was significantly increased by 3.56 times，9.54 times and 2.96 times，1.22 times and 2.4 times and 5.74 times respectively.GSH content and GSSH content of 5020，5020×389 and 5020×390 increased significantly by 54.0%，118.2% and 25.3%，18.0% and 22.0%，12.3% respectively after 12 d of aluminum treatment.[Conclusion]Triticale 5020×389 and 5020×390 are resistant to aluminum，and the aluminum tolerance 5020×390 is slightly stronger than 5020×389.At the same time，the results showed that the differences of APX，GPX and GR activity among different aluminum tolerant cultivars were one of the reasons that the differences of aluminum tolerance between triticale and its heterologous parents were significant.APX and APX may be the main action enzymes of 5020×390 aluminum-resistant，and GR may be the main action enzyme of 5020×389 aluminum-resistant

Key words Triticale；Wild hybridization；Aluminium toxicity；Reactive oxygen species

四倍體小麥（硬粒小麥AABB）品質好，但由于沒有D染色體，表現為不耐鋁毒[1]，黑麥（RR）有廣譜抗性，但品質差，將黑麥耐鋁基因導入到硬粒小麥，可以提高硬粒小麥耐鋁性。早在20 世紀60 年代國外已經獲得的有六倍體小黑麥Rosner 和57 等品種[2]。我國育種學家鮑文奎等也通過遠緣雜交成功合成了八倍體小黒麥。由于兼備了小麥和黑麥雙親的優良特點，小黑麥具有良好的高產性、較強的抗逆性和廣泛的適應性，小黑麥的成功繁育促進了小麥品種的進化和黑麥改良小麥育種的進程[3]。活性氧主要包括O2-、H2O2、·OH和1O2，在正常情況下植物細胞內SOD、GPX、CAT、GR、APX 等酶可以有效地清除細胞內的活性氧，維持細胞內活性氧代謝相對穩定。但如果活性氧過度積累，超過活性氧代謝的酶分解能力，將引發細胞膜酯化，破壞細胞膜系統，更嚴重的將會引起細胞的死亡[4]。鋁是地殼中最豐富的元素，且許多植物物種對土壤中鋁十分敏感，尤其是Al3+的形式的鋁[5]，受到鋁毒脅迫的植物表現出一種主要反應，即促進活性氧（ROS）的迅速產生，當植物受到鋁脅迫時活性氧產生和清除無法平衡時，就會導致活性氧的積累，以及膜系統、DNA分子、蛋白質及其他細胞成分的嚴重損傷[6-7]。筆者前期成功以四倍體小麥5020為母本，以黑麥近等系389 和390 為父本，遠源雜交獲得小黑麥5020×389與5020×390。在此基礎上，研究鋁脅迫下小黑麥和異源親本膜穩定性及活性氧代謝酶活性，從而提高硬粒小麥的耐鋁性，并揭示其耐鋁機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

四倍體小麥5020，近等系黑麥390（耐鋁性強）和389（耐鋁性弱）及其雜交種小黑麥5020×390 與5020×389。

1.2 試驗材料的培養

種子用0.5%次氯酸鈉消毒、蒸餾水清洗后置于4 ℃冰箱中催芽24 h，將露白發芽的種子進行沙培，植株大約10 cm時移栽到1/5 Hoagland營養液中，預培養7 d后進行處理，對照用1/5 Hoagland營養液繼續培養，鋁毒用含0.5 mmol/L AlCl3的1/5 Hoagland營養液培養，水培過程中每2 d更換1次營養液、每天08：00和18：00調節pH使之維持在4.5 以下，每小時定時通氣10 min。處理開始后6 h、2 d和12 d取材料進行生理指標測定。

1.3 葉中和活性氧代謝途徑相關的生理性指標測定

SOD 活性的測定參考 Gianopolotis和 Ries（1977）[8]， CAT 活性的測定參考 Rao等（1997）[9]的方法，丙二醛含量的測定參考 Dhindsa等（1981）[10]的方法，GR 和 APX 的活性測定參考李忠光等（2014）[11]的方法。H2O2 含量根據Yang 等[12]的方法測定。 GPX酶活性測定參考黃愛纓等[13]的方法。 GSH 和 GSSG 按照Aravind 等[14]的方法測定。

1.4 統計分析 采用SPSS Statistics 19 和Microsoft Excel 2010 軟件進行單因素方差分析，對數據處理、分析及制圖。

2 結果與分析

2.1 對小黑麥及其異源親本葉質膜透性、MDA 的影響

鋁脅迫后活性氧代謝平衡被打破，膜結構受破壞，透性增加，膜脂過氧化產物MDA大量積累。由圖1可知，隨著鋁 脅迫時間的延長， MDA 含量表現為先增加后減小。且在鋁處理2和12 d時增加顯著，5020、5020×389、5020×390 葉中MDA含量分別比無鋁處理增加了107.6%、93.9%、60.3% 和90.0%、68.0%、9.0%。5020 葉中MDA 含量顯著高于5020×389 和5020×390。質膜透性的變化與MDA 含量的變化一致，且在鋁處理2和12 d時5020、5020×389、5020×390葉中質膜透性分別比無鋁處理增加了57.7%、11.1%、10.8% 和22.8%、17.4%、2.2%。三者在鋁處理2 d時均顯著增加。鋁處理12 d時與無鋁處理相比，5020和5020×389增加顯著，5020×390增加不顯著，表明鋁處理增加小黑麥及其異源親本葉中膜質的過氧化及質膜透性，5020×389和5020×390 具有耐鋁性，且顯著高于5020，而5020×390 的耐鋁性強于5020×389。

2.2 對小黑麥及其異源親本葉中活性氧的影響

植物受到鋁脅迫時，會在植物細胞內大量產生和積累活性氧。鋁處理使三者的O2- 產生速率均不同程度的增加，且變化趨勢為先增加后減小，鋁處理6 h時5020×389和5020×390的葉中O2-產生速率顯著增加，5020增加不顯著；鋁處理2 d時三者的O2- 產生速率增加顯著，5020、5020×389 和5020×390 葉中O2- 產生速率比無鋁處理增加63.2%、41.1%、37%。且在鋁處理12 d時只有5020增加顯著。SOD酶可催化O2- 發生歧化反應，生成H2O2。鋁處理后5020、5020×389和5020×390葉的H2O2含量變化趨勢與O2- 產生速率趨于一致。鋁處理2 d時三者葉中H2O2含量顯著增加，5020、5020×389和5020×390增量為63.2%、47.1%、37%。與對照相比，鋁處理12 d時僅5020 增加顯著，表明鋁處理促進了葉中活性氧的積累。

2.3 對小黑麥及其異源親本葉中SOD的影響

SOD可以將植物細胞內超氧陰離子自由基歧化為氧分子和過氧化氫，其在維持細胞內O2- 產生和清除的動態平衡中起到重要作用。鋁處理使三者葉中SOD的活性隨著鋁處理的時間的延長而增加。鋁處理6 h時5020×389 和5020×390 葉的SOD 酶活性顯著高于5020，由于鋁處理初期5020×389和5020×390葉中的O2- 產生速率的增加。鋁處理2 d時和12 d與無鋁處理相比三者SOD 的酶活均顯著增加，5020、5020×389和5020×390 的增量為74.5%、63.2%、61.7% 和45.1%、31.4%、20.1%。表明隨著處理時間的延長，鋁處理可以顯著提高三者葉中SOD 的酶活。

2.4 對小黑麥及其異源親本葉中APX、CAT、GPX和GR活性的影響

APX，CAT，GR 和GPX 均可清除H2O2。APX 主要存在植物葉綠體和細胞質中催化AsA 與H2O2反應的抗氧化酶。GR 是維持植物細胞內谷胱甘肽穩定的重要酶，催化GSSG 還原為GSH。GPX 以GSH 為底物，清除H2O2，生成GSSH。與對照相比，鋁脅迫6 h后5020、5020×389 和5020×390 葉中APX活性顯著增加，分別增加了51.6%、3.74倍、11.9倍；Al脅迫2 d時5020、5020×390 葉中APX活性分別顯著減小了16%、19%，而5020×389葉中APX活性顯著增加了87.7%；Al脅迫12 d時，5020葉中APX活性顯著減小了75%，5020×389 和5020×390 葉中APX活性顯著增加，分別增加了3.56倍、9.54倍。

與對照相比，鋁脅迫2～12 d時，5020、5020×389 和5020×390 葉中CAT活性顯著增加，分別增加了112.6%、24.5%、21.4%與51.9%、8.85%、3.96%。

5020、5020×389 和5020×390 葉中GR 酶隨著脅迫時間的延長逐漸增大。與對照相比，Al處理6 h時5020葉中GR活性減小不顯著，5020×389 和5020×390 葉中GR 酶顯著增加了1.62、4.1倍；Al處理2 d時5020、5020×389 和5020×390 葉中GR 酶分別顯著增加了10.1%、4.45倍、1.05倍；Al處理6 h時5020葉中GR活性顯著減小了18.8%，5020×389 和5020×390 葉中GR 酶增加顯著增加了2.96、1.22倍。

與對照相比，鋁脅迫2 d后 5020、5020×389 和5020×390 葉中GPX活性分別顯著減小了67.7%、58.0%、40.2%；鋁脅迫12 d后5020葉中GPX活性顯著減小了69.0%，5020×389 和5020×390葉中GPX活性分別顯著增加了2.40、5.74倍。

2.5 對不同小黑麥及其異源親本葉中GSH 和GSSG 含量的影響

GSH在清除活性氧的過程中給起到重要作用，可直接與活性氧反應將其還原，又可作為酶的底物在活性氧的清除過程中扮演重要角色。GSH可以和H2O2 反應生成GSSH 來清除H2O2。鋁處理促進5020、5020×389 和5020×390 葉中GSH 和GSSH 含量的增加。5020、5020×389 和5020×390 的對照組葉中GSH 含量的變化為先減小后增加，5020×390 的鋁脅迫組葉中GSH 含量的變化為先增加后減小，且GSSH含量的變化趨勢為先減小后增加。5020、5020×389、5020×390的GSH和GSSH含量均在鋁處理12 d時顯著增加，增量分別為54.0%、118.2% 和25.3%、18.0% 和22.0%、12.3%。5020 葉中GSH 含量在鋁處理12 d時達到最大，表明長時間的鋁處理顯著提高5020 葉中GSH 含量，增加其清除H2O2 的能力。

3 討論

植物受到Al脅迫后活性氧代謝平衡被打破，膜結構受破壞，透性增加，膜脂過氧化產物MDA大量積累。鋁脅迫促進5020、5020×389 與5020×390 的質膜透性、顯著增加MDA 含量，且在鋁處理2 和12 d時5020×389與5020×390的質膜透性和MDA含量的增加量顯著低于5020，表明5020×389與5020×390表現為耐鋁性。5020×390 葉中質膜透性和MDA含量的增加量最小，說明5020×390強于5020×389。耐鋁性的黑麥和不耐鋁的四倍體小麥雜交可顯著調高四倍體小麥的抗性。

鋁脅迫使植物體活性氧大量積累。活性氧包括超氧自由基、過氧化氫、羥自由基和單線態氧等。鋁脅迫促進5020、5020×389 與5020×390 中O2- 產生速率，顯著增加H2O2 的含量。何虎翼等[15]研究發現鋁脅迫根中產生O2- 可能被SOD 催化轉變為H2O2，再轉運到葉片作為信號因子，誘導整體植株的抗性，這可能與鋁脅迫6 h 時5020×389與5020×390葉中H2O2含量增加有關。SOD 酶作為抗氧化系統的第一道防線可以將O2- 轉化為H2O2，顯著增加O2-產生速率，促進SOD 酶活性增加，進而促進H2O2 含量的增加，H2O2 的含量的變化均呈先增加后減小的趨勢。O2- 產生速率和H2O2含量的減小可能與SOD、CAT、APX 等的抗氧化酶協作有關。

作為清除O2-的重要酶，SOD在活性氧代謝中起到重要作用。鋁脅迫促進5020、5020×389 與5020×390 葉中SOD 酶活顯著增加，尤其在鋁處理 2 d 時。韋冬萍等[16]研究發現200 μmol/L Al3+ 濃度可顯著提高油菜葉中SOD 酶活性，與該試驗結果一致。

CAT、APX、GR 和GPX 均可清除H2O2。在鋁脅迫12 時5020的APX、GR 和GPX活性均顯著減小，但5020×389、5020×390葉中APX、GR 和GPX活性顯著增加，表明提高活性氧代謝酶活性是小黑麥耐鋁毒毒害的主要形式。 5020×389、5020×390在鋁脅迫葉中APX、GR 和GPX活性變化顯示，APX與GPX可能是5020×390耐鋁的主要作用酶，GR可能是5020×389耐鋁的主要作用酶。5020在鋁處理12 d時，APX活性顯著減小，這可能由于鋁毒抑制APX 活力，也可能與鋁脅迫APX 酶蛋白降解有關[17]。在鋁處理12 d 時，5020 的CAT酶活顯著升高。有研究表明葉片中清除H2O2 主要依靠葉綠體類囊體膜上的上的APX和微體中的CAT[18]，在鋁處理12 d時5020葉中APX 酶活減弱，通過增強其葉中CAT 的活力來增強清除葉中H2O2的能力。

GR 是維持細胞內GSH穩定的重要酶。Al脅迫促進了葉中GR和GSH含量的增加，在鋁處理12 d時5020和5020×390的葉中GR 活性最大，同時其葉中GSH 含量也最大。5020、5020×389和5020×390的GSH含量與對照相比均顯著增加，表明通過提高抗氧化劑的含量來提高小黑麥及其異源親本耐鋁毒毒害的能力。但是5020、5020×389和5020×390的GR 活性變化趨勢和GSH含量并不一致，這可能由于GSH 并不是全由GR 這一條途徑合成，GSH也可由γ-ECS 和GSHS 催化合成。

4 結論

小黑麥5020×389和5020×390 表現為具有耐鋁性，且5020×390 耐鋁性強于5020×389。不同耐鋁品種間葉的APX、GPX和GR活性差異是小黑麥及其異源親本耐鋁性差異顯著的原因之一。APX與GPX可能是5020×390耐鋁的主要作用酶，而GR可能是5020×389耐鋁的主要作用酶。

參考文獻

[1] 曾道孝.硬粒小麥簡介[J].農業科技通訊，1979（12）：6.

[2] WILSON A S.III.-On the fertilisation of the cereals[J].Trans Proc Bot Soc Edinburgh，1873，12（1/2/3/4）：84-95.

[3] 楊漫宇.小麥-黑麥1RS/1BL易位系及4RS/4DL新型易位系的鑒定及分子細胞遺傳學研究[D].雅安：四川農業大學，2014：2-3.

[4] MITTLER R.Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J].Trends Plant Sci，2002，7（9）：405-410.

[5] CHEN L S，QI Y P，JIANG H X，et al.Photosynthesis and photoprotective systems of plants in response to aluminum toxicity[J].Afr J Biotechnol，2010，9：9237-9247.

[6] INZ D，MONTAGU M V.Oxidative stress in plants[J].Curr Opin Plant Biotech，1995，6（2）：153-158.

[7]DEL RIO L A.ROS and RNS in plant physiology：An overview[J].J Exp Bot，2015，66（10）：2827-2837.

[8]GIANNOPOLITIS C N，RIES S K.Superoxide dismutases：I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiol，1997，59（2）：309-314.

[9] RAO M V，PALIYATH G，ORMROD D P，et al.Influence of salicylic acid on H2O2 production，oxidative stress，and H2O2-metabolizing enzymes[J].Plant Physiol，1997，115（1）：137-149.

[10] DHINDSA R S，PLUMB-DHINDSA P，THORPE T A.Leaf senescence：Correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation，and decreased levels of superoxide dismutase and catalase[J].J Exp Bot，198132：93-101.

[11] 李忠光，龔明.植物生理學綜合性和設計性實驗教程[M].武漢：華中科技大學出版社，2014：59-60.

[12] YANG Y J，CHENG L M，LIU Z H.Rapid effect of cadmium on lignin biosynthesis in soybean roots[J].Plant Sci，2007，172：632-639.

[13] 黃愛纓，吳珍齡.水稻谷胱甘肽過氧化物酶的測定法[J].西南農業大學學報，1999，21（4）：324-327.

[14] ARAVIND P，PRASAD M N V.Modulation of cadmium-induced oxidative stress in Ceratophyllum demersum by zinc involves ascorbate-glutathione cycle and glutathione metabolism[J].Plant physiology and biochemistry，2005，43（2）：107-116.

[15] 何虎翼，何龍飛，黎曉峰，等.鋁脅迫對黑麥幼苗活性氧系統的影響[J].麥類作物學報，2005，25（6）：91-95.

[16] 韋冬萍，劉鵬，徐根娣，等.Al脅迫下油菜生物量Al積累及保護酶系統的響應[J].農業環境科學學報，2008，27（6）：2351-2356.

[17] 蔣明義，荊家海.植物體內羥自由基的產生及其與脂質過氧化作用啟動的關系[J].植物生理學通訊，1993（4）：300-305.

[18] 馮晴，徐朗萊，葉茂炳，等.小麥葉片衰老過程中CAT和APX活力及其同工酶譜的變化[J].南京農業大學學報，1997，20（2）：95-99.