不同品系金銀花質量評價

譚政委　夏偉　許蘭杰

摘要[目的]評價不同品系金銀花藥材質量。[方法]采用HPLC和紫外分光光度法測定相同產地5個不同品系金銀花藥材成分綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素和總黃酮的含量，采用方差分析、相關性及主成分分析方法對5個品系金銀花成分間的差異及相關性進行評價。[結果]相關性分析中，綠原酸與木犀草苷，異綠原酸A與異綠原酸C，異綠原酸A和異綠原酸C與總黃酮均呈現顯著正相關，相關系數分別為0.648、0.833、0.690和0.636；異綠原酸A和異綠原酸C與木犀草素，蘆丁和木犀草素與總黃酮均呈顯著負相關，其相關系數分別為-0.081、-0.688、-0.476和-0.595。主成分分析綜合評價中豫金2號（YJE）金銀花評分較高，其次為豫封3號（YFS）金銀花，評分中排序最低的為由山東引種的北花1號（BHYH）金銀花。[結論]通過對5個品系金銀花藥材內在成分進行評價，為金銀花藥材質量的評價、指導金銀花規范化種植及新品系的選育提供理論依據。

關鍵詞金銀花；內在成分；質量評價；主成分分析

中圖分類號R284文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0168-04

Quality Evaluation of Honeysuckle in Different Strains

TAN Zhengwei， XIA Wei， XU Lanjie et al

（Sesame Research Center， Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract[Objective] The research aimed to evaluate the quality of different strains of honeysuckle. [Method]HPLC and UV spectrophotometry were used to determine the contents of chlorogenic acid， rutin， Luteoloside， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C， luteolin and total flavonoids in five different strains of honeysuckle in the same place.The differences and correlations between the five honeysuckle components were evaluated by analysis of variance， correlation and principal component analysis.[Result]In the correlation analysis，chlorogenic acid and mignonette glycosides， isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C， isochlorogenic acid A and total flavonoids ，isochlorogenic acid C and total flavonoids were significantly positive correlation，the correlation coefficients were 0.648， 0.833， 0.690 and 0.636， respectively；Isochlorogenic acid A and luteolin， isochlorogenic acid C and luteolin， rutin and total flavonoids， luteolin and total flavonoids were significant negative correlation，the correlation coefficients were -0.081，-0.688，-0.476 and -0.595， respectively. Through the main component analysis，the YJE score was higher， followed by YFS， and the lowest ranking in the score was BHYH.[Conclusion]By evaluating the internal components of five strains of honeysuckle medicinal materials， it provides a theoretical basis for the evaluation of the quality of honeysuckle medicinal materials， the standardization of honeysuckle planting and the breeding of new strains.

Key wordsHoneysuckle；Inner composition；Quality evaluation；Principal component analysis

金銀花為傳統大宗藥材之一，主要來源于忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花[1]。忍冬史載于《肘后備急方》，首次以金銀花入藥記載于《救荒本草》[2-3]。傳統意義上金銀花具有清熱解毒、疏散風熱等功效，主要應用于風熱引起的感冒。現代研究表明，金銀花主要含有揮發油類、黃酮類和有機酸類等成分，具有解熱抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽等作用[4-5]。金銀花主產于我國河南、山東、河北等地，且以河南產“密銀花”“封丘金銀花”與山東產“濟銀花”較為道地[6]。根據對金銀花文獻查閱可知，不同品系、不同產地金銀花內在質量會有所不同。

長期以來金銀花主要以人工栽培為主，品系的退化、病蟲害的蔓延、產地的遷移、管理水平的不規范，使得金銀花品系退化、產量下降、質量降低。提高金銀花的質量及產量成為迫切需要。筆者以河南省農業科學院現代農業研究開發基地（113°42′24″E，35°00′36″N）內不同品系金銀花為研究對象，根據不同品系金銀花內在活性成分及總黃酮為指標進行評價，優選優良品系金銀花，為更好地發展利用、保護金銀花種質資源及選育金銀花新品系提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。金銀花采自河南省農業科學院現代農業研究開發基地，采用隨機定株采樣的方法，經河南省農業科學院梁慧珍研究院鑒定為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾。樣品信息見表1。

1.1.2試劑。對照品綠原酸（東京化成工業株式會社，批號EBWZE-MS，純度>98.0%）；蘆丁（國藥集團化學試劑有限公司，批號20160725，純度>95%）；木犀草苷和木犀草素（aladdin，批號分別為J1624002、H1617004，純度>98%）；異綠原酸A和異綠原酸C（成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-17030621、MUST-17021603，純度分別大于98.82%、99.84%）；色譜級甲醇（J.T.Baker）；色譜乙腈（J.T.Baker）；色譜甲醇（天津四友化學有限公司）；無水乙醇（天津四友化學有限公司，分析純）；無水三氯化鋁（天津市風船化學試劑科技有限公司，分析純）；亞硝酸鈉（天津市大森化工產品銷售有限公司，分析純）；氫氧化鈉（天津市華東試劑廠，分析純）；純凈水為哇哈哈純凈水。

1.1.3儀器。Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，包括二元泵，自動進樣器，DAD 紫外檢測器）；美譜達UV-3200紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；KQ3200DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1HPLC法測定活性成分[7-8]。

1.2.1.1色譜條件。

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm） ，流動相為乙腈（B）-0.3%磷酸水溶液（A）；梯度洗脫：0～11 min，90～82A；11～30 min，82～80A；30～40 min，80A；40～50 min，80～75A；50～60 min，75～70A；體積流量1.0 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長348 nm，柱溫30 ℃。

1.2.1.2混合對照品溶液制備。分別精密稱取綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素對照品于10 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，得到各成分濃度分別為0.646、0.290、0.400、2.980、0.100、0.190 mg/mL的混合對照品溶液。

1.2.1.3供試品溶液制備。將金銀花樣品用電熱恒溫鼓風干燥箱烘干，后將其粉碎、過篩后，稱取樣品粉末0.5 g于三角瓶中，加入25 mL 70%甲醇溶液，搖勻，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）40 min，搖勻過濾，得供試品溶液。

1.2.1.4線性關系考察。

精密量取適量混合標準品溶液，加70%甲醇分別稀釋0、3、5、7、10、20倍，搖勻，分別按照“1.2.1.1”色譜條件依次進樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y）、對照品質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，進行線性回歸。

安徽農業科學2018年

1.2.1.5精密度試驗。

精密吸取混合標準品溶液，按“1.2.1.1”色譜條件將所得溶液經0.22 μm有機微孔濾膜過濾后，連續進樣6次、每次10 μL進行測定，記錄峰面積并進行計算。

1.2.1.6重復性試驗。

精密稱取同一批金銀花樣品6份，按“1.2.1.3”方法平行制備成6份供試樣品溶液，按“1.2.1.1”色譜條件進樣10 μL進行測定，記錄峰面積并計算各成分的含量，然后計算RSD值。

1.2.1.7穩定性試驗。

精密稱取一份金銀花樣品，按“1.2.1.3”方法制備供試樣品溶液，按“1.2.1.1”色譜條件檢測，分別于0、4、8、16、24、32 h進樣10 μL進行測定，并記錄各成分峰面積，按照峰面積計算RSD。

1.2.1.8加樣回收率試驗。

精密稱取已知6種成分含量的同一金銀花樣品6份，分別加入適量的6個成分標準品，并按照“1.2.1.3”方法制備供試樣品溶液，按“1.2.1.1”色譜條件進樣10 μL進行測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。

1.2.2紫外-可見分光光度計測定總黃酮。

1.2.2.1金銀花提取液的制備。精確稱定金銀花粉末（過4號篩）0.25 g，加入50%的乙醇25 mL，50 ℃條件下超聲（150 W，40 kHz）浸提處理35 min后過濾，得到的澄清過濾液體即為金銀花提取液。

1.2.2.2總黃酮的測定及標準曲線的繪制[9]。以蘆丁為標準樣，用紫外分光光度計法測定金銀花提取物的總黃酮含量，在510 nm波長處比色定量測定黃酮含量。具體步驟為：準確稱取于120 ℃干燥至恒重的蘆丁0.020 7 g，用甲醇定容至100 mL，得濃度0.207 mg/mL的標準應用液。準確吸取標準應用液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于6支具塞試管中，加30%乙醇至5 mL再加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻放置6 min；加入0. 3 mL 10% A1Cl3溶液，搖勻并放置6 min后加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液；加入0.4 mL水，搖勻放置15 min；于510 nm波長處測定吸光度，繪制吸光度（y）–濃度（x）的標準曲線。

1.2.2.3金銀花黃酮樣液的測定方法。準確吸取0.5 mL提取液并依據“1.2.2.2”測定方法進行測定，同時以實際空白組做對照，于510 nm波長處測定其吸光度，具體計算參照樊琛等[9]的總黃酮含量計算。

2結果與分析

2.1HPLC方法學考察

2.1.1線性關系考察。由表2可知，各對照品在各自質量濃度范圍內線性關系良好。

2.1.2精密度試驗。按照“1.2.1.5”操作，計算得出綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素相對應

的RSD值分別為0.33%、0.58%、0.24%、0.15%、128%、0.26%，表明該方法精密度良好。

2.1.3重復性試驗。按照“1.2.1.6”操作，計算得出綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素的RSD值分別為0.65%、0.261%、1.22%、0.47%、1.09%和203%，表明該測定方法的重復性良好。

2.1.4穩定性試驗。按照“1.2.1.7”操作，計算得出綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素的峰面積的RSD分別為0.63%、2.91%、2.29%、0.70%、1.51%和2.83%，表明供試樣品溶液在32 h內穩定。

2.1.5加樣回收率試驗。按照“1.2.1.8”操作，結果發現（表3），綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素的RSD分別為2.21%、2.53%、2.62%、2.76%、199%和2.45%。

2.2總黃酮的標準曲線繪制以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線（圖1），得出回歸方程y=11.564x+0002 3（R2=0.999 6）。

2.3不同品系金銀花6種成分及總黃酮結果

對河南省農科院藥用植物基地內不同品系金銀花隨機選取5～10株，選擇開花期一致的金銀花采樣，并將其在45 ℃烘干，打粉，過4號篩，依據HPLC方法及總黃酮檢測方法對不同品系金銀花6種成分及總黃酮進行測量，結果見表4。

由表4可知，不同品系金銀花所含化學成分有所差異，但就藥典規定測定的綠原酸、木犀草苷而言，品系間差異無顯著性；蘆丁含量，YFY與其他品系間差異顯著；異綠原酸

A、異綠原酸C、木犀草素和總黃酮含量，品系間也存在一定的差異性。

2.4金銀花中6種成分、總黃酮間的相關性分析

金銀花在代謝過程中，往往會存在一定的相關性，這也為金銀花化學成分合成代謝及直觀分析金銀花提供可能性。由表5可知，金銀花各化學成分間有一定的相關性，綠原酸與木犀草苷、異綠原酸A與異綠原酸C、異綠原酸A和異綠原酸C與總黃酮均呈極顯著正相關，相關系數分別為0.648、0.883、0690和0.636；蘆丁與總黃酮含量呈顯著負相關，相關系數為-0.476；異綠原酸A和異綠原酸C與木犀草素、木犀草素與總黃酮含量均呈現極顯著負相關，相關系數分別為-0.810、-0.688和-0.595。

2.5不同品系金銀花主成分分析計算相關系數的特征值和方差貢獻率，第1、2、3主成分的累計方差貢獻率為89565%，所以選取3個主成分進行評價即可，它代表了不同品系金銀花所測指標89.565%的信息量。

根據各成分含量（Z）和主成分計算公式可以得到線性組合如下：

成分1得分：F1=0.340 8×Z（綠原酸）+0.299 7×Z（蘆丁）+0.207 3×Z（木犀草苷）-0.408 4×Z（異綠原酸A）-0.271 5×Z（異綠原酸C）+0.514 8×Z（木犀草素）-0.495 7×Z（總黃酮）

3討論

由HPLC與紫外分光光度法對同一產地5個品系金銀花結果可知，5個品系金銀花所含化學成分各有差異，綠原酸與木犀草苷間含量雖有差異，但差異不顯著，而其他4種成分及總黃酮含量，不同品系金銀花存在差異且差異顯著，說明綠原酸與木犀草苷含量在這5個品系間具有一定的一致性，其他成分的差異表明品系間的差異。

各成分間相關性分析結果可知，不同成分間均呈現一定的相關，其中綠原酸與木犀草苷、異綠原酸A與異綠原酸C、異綠原酸A和異綠原酸C與總黃酮在這5個品系金銀花中呈現顯著正相關，相關系數分別為0.648、0.833、0.690和0636；異綠原酸A和異綠原酸C與木犀草素、蘆丁和木犀草素與總黃酮在5個品系金銀花中均呈現顯著負相關，其相關系數分別為-0.081、-0.688、-0.476和-0.595。由以上結果可以表明，在評價這5種品系金銀花時，綠原酸可以在一定程度上代表木犀草苷，異綠原酸A在一定程度上反映出異綠原酸C、總黃酮與木犀草素的含量；另利用蘆丁與木犀草素指標成分在一定程度上可以預測這5個品系金銀花總黃酮含量。5個品系金銀花內在成分相關性分析結果亦說明金銀花7個成分代謝存在一定的相互依存、相互促進或抑制的關系。

由5個品系金銀花內在成分對其進行主成分分析，結果顯示，綜合評價中豫金2號金銀花評價最高，其次為豫封3號金銀花，評價中排序最低的為由山東引種的北花一號金銀花。由主成分結果可知，金銀花內在質量存在差異，這可能與其品種的特異性及地理氣候的影響有關，這為今后各地區引種金銀花適宜性評價提供了很好的試驗證據。

該試驗通過對5個品系金銀花進行方差分析、相關性分析可知，5個品系金銀花所含成分均有所差異，且各成分間存在一定的相關性；通過主成分分析對5個品種金銀花綜合評價，說明各品系金銀花之間存在一定差異。綜上所述，通過對5個品系金銀花藥材內在成分及品系進行評價，為金銀花藥材質量的評價、指導金銀花規范化種植及新品系的選育提供理論依據。

參考文獻

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