凍雞肉中金黃色葡萄球菌LAMP快速檢測方法的建立

袁光宇　謝體波　龔維瑤

摘要[目的]建立凍雞肉中金黃色葡萄球菌的LAMP檢測方法。[方法]根據金黃色葡萄球菌特異性耐熱核酸酶基因序列設計2對引物，建立LAMP檢測方法，并用于檢測采購自貴陽市各大超市的凍雞肉樣品。[結果]設計合成的2對引物和建立的LAMP方法檢測金黃色葡萄球菌具有良好的特異性，反應體系的靈敏度為65 CFU/mL。檢測采購自貴陽市各大超市和經人為污染的264份凍雞肉樣品分別用LAMP方法檢測，并用國標方法檢測驗證，其特異性為95.2%，準確度為97.3%。[結論]該研究建立的方法為實現在凍雞肉中金黃色葡萄球菌的快速檢測奠定了良好的基礎。

關鍵詞金黃色葡萄球菌；LAMP；檢測方法；凍雞肉

中圖分類號S851.34+7文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0162-02

Establishment of Rapid Detection Method of Staphylococcus aureus LAMP in Frozen Chicken

YUAN Guangyu， XIE Tibo，GONG Weiyao et al

（Guizhou Kwinbon Science and Technology for Food Safety Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550009）

Abstract[Objective] The research aimed to establish a LAMP method for detection of S. aureus in frozen chicken. [Method] Two pairs of primers were designed based on the nuc gene sequence of S. aureus. A LAMP detection method was established and used to detect frozen chicken samples from major supermarkets in Guiyang.[Result]Two pairs of primers and the established LAMP method had good specificity for the detection of S. aureus. The sensitivity was 65 CFU/mL. 264 frozen chicken samples purchased from major supermarkets in Guiyang and polluted by humans were detected by LAMP method and verified by national standard method. The specificity was 95.2% and the accuracy was 97.3%.[Conclusion]The method established in this study laid a good foundation for rapid detection of S. aureus in frozen chicken.

Key wordsStaphylococcus aureus；LAMP；Detection method；Frozen chicken

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）簡稱金葡菌，是一種革蘭氏陽性需氧或兼性厭氧菌，廣泛分布于人類生活環境中，多寄生在人和動物的表皮、呼吸道、消化道及化膿性傷口[1-2]。金葡菌無運動能力，不產生芽孢，最適生長環境為溫度37 ℃、pH 7.4，能夠適應10%的高鹽環境[3]。金葡菌本身不具致病性，但其在繁殖過程合成腸毒素，從而導致食物中毒，出現惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀[4-5]。食品在生產、加工過程中的不嚴格管控，極易受該菌污染。

在國內，由金葡菌導致的食物中毒事件時有發生[6-7]。同時，凍品被檢測出金葡菌污染也時有報道[8]。目前，對金葡菌的主要檢測方法有國標方法、PCR、免疫檢測等[9-10]。各檢測方法各有所長，國標方法準確檢測率100%，但操作要求無菌，檢測周期較長，無法實現快速出結果；免疫檢測方法雖然時間較短，但受到靈敏度的制約[9]；PCR方法也需要精密儀器實現控制溫度變化，并且靈敏度也較低[11]。

環介導等溫擴增（LAMP）由Notomi等[12]于2000年開發的一種基于PCR的DNA恒溫擴增方法，其具有特異性高、靈敏度高、檢測速度快等特點，被應用在微生物、寄生蟲的檢測等領域[13-15]。筆者根據金葡菌的特異性nuc基因序列設計引物，實現在凍雞肉中金葡菌的快速檢測，以期為凍品中金葡菌的快速檢測奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒DP302購自天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；Isothermal Mix、熒光等溫擴增儀GENEⅡ型購自OptiGene公司；試驗菌株信息為金黃色葡萄球菌（CGMCC 1.282）、大腸桿菌（CICC 10003）、枯草芽孢桿菌（CGMCC 1.821）、單增李斯特菌（CMCC 54003）、傷害沙門氏菌（CMCC 50071），由北京勤邦生物技術有限公司提供；凍雞肉購自貴陽市各大超市。

1.2研究方法

1.2.1引物設計。

根據在GenBank中查詢到金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶（nuc）基因序列（GenBank DQ507382.1），分別設計2對引物，引物序列如表1所示。

1.2.2LAMP反應體系的建立。

試驗菌株按試劑盒方法步驟提取DNA，并測定核酸濃度。以提取的DNA作為模板，建立20 μL反應體系。PCR管中依次加入等溫擴增混合液10 μL、引物F3/B3（0.2 μmol/L）1 μL、引物FIP/BIP（0.8 μmol/L）1 μL、DNA模板（50 μg/L）1 μL、ddH2O 7 μL。將反應體系混合均勻，放入熒光等溫擴增儀，65 ℃擴增45 min。

1.2.3LAMP檢測方法的特異性和靈敏度。

為驗證設計的引物序列經LAMP檢測金葡菌nuc基因序列特異性，將菌株金黃色葡萄球菌（CGMCC 1.282）、大腸桿菌（CICC 10003）、枯草芽孢桿菌（CGMCC 1.821）、單增李斯特菌（CMCC 54003）、傷害沙門氏菌（CMCC 50071）按適宜培養條件液體培養過夜，按試劑盒方法提取細菌基因組DNA，測定DNA濃度，定量至50 μg/L。以細菌基因組DNA作為模板，用“1.2.2”建立的方法驗證特異性。

將金葡菌按10倍梯度稀釋至10-8，國標方法（GB 4789.10—2016）進行菌落計數，測定金葡菌菌活數。將各稀釋菌液煮沸、離心，取1 μL作為模板，用于驗證LAMP方法的靈敏度。

1.2.4凍雞肉中金葡菌的檢測。

將采購自各大超市的金葡菌陰性凍雞肉，取50 g接種已知濃度的金葡菌進行污染，作為陽性樣本，以不添加金葡菌株凍雞肉作為陰性樣本，共計264份。分別用國標方法（GB 4789.10—2016）和LAMP方法盲檢。

2結果與分析

2.1LAMP檢測的特異性

經熒光等溫擴增儀擴增金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、傷害沙門氏菌5株致病菌基因組DNA，結果如圖1所示。結果顯示，金黃色葡萄球菌熒光信號呈指數增加，其余4株均未檢測到熒光信號的變化，表明設計的nuc基因序列用于LAMP檢測金黃色葡萄球菌特異性高。

2.2LAMP檢測的靈敏度

金葡菌經一系列稀釋后，對各稀釋度利用建立的LAMP檢測熒光信號，結果如圖2所示。結果顯示，5個梯度（32、47、65、82、100 CFU/mL）中，隨著時間增加32、47 CFU/mL熒光信號均未變化，65 CFU/mL在30 min左右開始檢測到熒光信號增強，82、100 CFU/mL均在反應開始較短時間內熒光信號開始增強。因此，金葡菌靈敏度能夠達65 CFU/mL，說明試驗建立的LAMP方法具有較高的靈敏度。

2.3LAMP檢測凍雞肉

將采購自貴陽市各大超市凍雞肉和人為污染凍雞肉，根據建立的LAMP和國標方法檢測金葡菌，結果顯示，測出陽性樣品分別為LAMP方法138份，國標方法145份；陰性樣本分別為LAMP方法126份，國標方法119份。分析結果可知建立的LAMP檢測特異性為95.2%，準確度為973%。

3討論與結論

凍雞肉因其長期存放在低溫環境，并不適于微生物的生長需求，因此在受到微生物污染后，短時間內并不會出現明顯的變質，但仍然存在微生物污染后的潛在危險。因此建立一種快速準確的檢測方法相當重要。金葡菌是食品污染的主要菌之一，其檢測方法中國標方法檢測主要受時間的制約，每次檢測約需48 h，耗時耗力[16]。PCR方法受靈敏度的限制，現有文獻報道的其檢測限多在103～105 CFU/mL[17-18]。而LAMP方法很好地避免了以上2種方法存在的問題，能夠實現凍品更快速準確的檢測需求。

該研究利用金葡菌nuc基因作為檢測基因，建立一種LAMP技術快速檢測凍雞肉中金葡菌的方法。根據基因序列（GenBank DQ507382.1）設計的2對引物，建立的LAMP檢測金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、傷害沙門氏菌的基因組DNA，以驗證設計的2對引物檢測金葡菌特異性。為獲取足量細菌基因組DNA，檢測前對5株菌株分別進行擴增。擴增細菌經試劑盒方法提取，測定核酸蛋白濃度并統一稀釋至50 μg/L用于LAMP檢測。檢測結果顯示，5株菌株僅金葡菌熒光信號呈指數增強，表明nuc基因作為金葡菌檢測具有特異性。金葡菌菌液經一系列稀釋，菌液分別用于LAMP檢測熒光信號強度、國標方法確定活菌數。檢測結果顯示，建立的LAMP方法靈敏度為65 CFU/mL。該研究建立的LAMP方法與國標方法分別盲檢采購自貴陽市各大超市凍雞肉及人為污染的凍雞肉264份，由結果可知LAMP檢測特異性為95.2%，準確度為973%，表明該研究建立的LAMP快速檢測方法檢測結果可靠，準確度、特異度高。

參考文獻

[1] KHAN S，RASHEED F，ZAHRA R.Genetic polymorphism of agr locus and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus at two hospitals in Pakistan[J].Pak J Med Sci，2014，30（1）：172-176.

[2] GITAU G K，BUNDI R M，VANLEEUWEN J，et al.Evaluation of PetrifilmsTM as a diagnostic test to detect bovine mastitis organisms in Kenya[J].Trop Anim Health Prod，2013，45（3）：883-886.