抑制農業病害真菌的海洋微生物篩選及發酵工藝優化

曲均革 吳慧梅 陳雄劍

摘要 [目的] 從海洋中篩選對農業病害真菌有較強拮抗作用的海洋微生物。[方法] 以5種農業病害真菌為篩選模型，采用平皿拮抗法對分離獲得的菌株進行初步篩選，對有活性的菌株再進行復篩，并選擇活性高的菌株進行發酵工藝優化。[結果] 初篩中有拮抗作用的海洋細菌有21株，進行復篩后菌株MB133在稻瘟菌平板上抑菌效果最明顯，菌株MB025、MB026、MB133在油菜菌核病菌、辣椒炭疽病菌、番茄灰霉病菌平板上均存在抑菌效果。抑菌效果最明顯的菌株MB133的優化發酵工藝：最適裝液量為12%，最適接種量為2.0%，最適培養基pH 7.0。[結論]該研究為農用抗生素的推廣和應用奠定了資源基礎。

關鍵詞 海洋細菌；農業病害真菌；篩選；農用抗生素

中圖分類號 Q938文獻標識碼

A文章編號 0517-6611（2018）15-0007-03

Abstract [Objective]The aim was to screen the marine microorganisms with strong antagonism to the agricultural disease fungi.[Method] Five kinds of agricultural disease fungi were selected as screening models，and the isolated strains were screened by Petri dish antagonism.The active strains were rescreened，and the strain with highest activity was selected to optimize the fermentation process.[Result] There were 21 strains of marine bacteria that had antagonistic effects in the initial screening.The bacteriostasis effect of MB133 strain on the plate of Pyricularia oryzae was most obvious after rescreening. The bacteriostasis effects of MB025，MB026 and MB133 strains on Sclerotinia sclerotiorum，Colletotrichum capsic and Botrytis cinerea were also found.The optimum fermentation process of MB133 strain was as followed：the optimum liquid amount was 12%，and the optimum inoculation amount was 2.0%，the optimum medium was pH 7.0.[Conclusion] This research has laid the resource base for the popularization and application of agricultural antibiotics.

Key words Marine bacterium；Agricultural disease fungi；Strain screening；Agricultural antibiotics

農業是人類的生存之本，農藥是糧食和蔬果產量的重要保障。化學農藥的使用是農業生產史上的一次重大變革，為現代農業的發展做出了突出貢獻。然而，大規模使用化學農藥，在確保了糧食和蔬果產量提高的同時，也給生態環境和人類健康帶來了巨大威脅[1-4]。微生物農藥具有選擇性強、抗菌譜廣、活性功能多樣化及活性物質豐富、不易出現抗性、不污染環境以及對動植物安全等優點。由于海洋微生物所處的生態環境的獨特性，導致海洋生物體內新陳代謝過程與陸地生物不同，可能產生許多結構新穎、作用特殊的活性物質。海洋微生物還具有生產周期短，不受季節、地域和病蟲害條件限制等多種優良性質[5-9]。我國既是一個農業大國，也是一個海洋大國，從海洋微生物資源中尋找具有特殊功能的活性物質應用于農業是一個較新的研究方向，有著很強的創新性和巨大的應用潛力[10]。隨著植物病原菌對已有農藥的耐藥性及新病害的出現，要求人們不斷開發新的農藥。尋找新的微生物源農用活性先導化合物是農藥創制的主要手段之一。筆者結合浙江的地域優勢和資源特色，從浙江海域的海洋微生物中開發了具有抗農業病害真菌特性的農用抗生素，對推動具有浙江特色的海洋經濟的快速發展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試海洋細菌。

待篩選的海洋細菌菌株為實驗室中從寧波洋沙山和象山海域分離純化到的菌種資源。

1.1.2 供試病原菌。

稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，ACCC 36028）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani，ACCC 36246）、 油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsic，ACCC 37049）均來源于中國農業微生物菌種保藏中心。

1.1.3 培養基。

富集、活化、發酵培養采用2216E液體培養基，病源真菌培養采用PDA培養基。

1.2 方法

1.2.1 農業病害菌的接種培養。

取事先配制好的PDA培養板用于培養稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，ACCC 36028）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani，ACCC 36246）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsic，ACCC 37049）5種病害菌。將保藏好的5種病害菌的斜面培養基，利用接種鏟依次將5種病害菌接種至相應的平板正中間，平板上做好相應的標記，將接種后的所有培養板置于25 ℃培養箱中培養3 d。

1.2.2 活化分離得到的海洋細菌。

取保藏的海洋細菌，接種于2216E液體培養基（25 mL/250 mL錐形瓶）中，于23 ℃、150 r/min恒溫搖床培養24 h。

1.2.3 離心取活化細菌的發酵產物。

取2 mL活化后的海洋細菌菌懸液于離心管中， 4 ℃、11 000 r/min條件下冷凍離心10 min，取上清液。

1.2.4 抗農業病害真菌農用抗生素活性菌株篩選。

初篩利用牛津杯法，將活化細菌的離心發酵液與5種病害菌置于PDA平板上對峙培養。在每塊平板下方用記號筆劃出6個相等的區域，每個區域標上相應的編號，每塊接種6株海洋細菌發酵液。用鑷子夾取牛津杯于酒精燈上灼燒后放于平板對應位置，用移液槍加入200 μL菌液上清于對應平板分區的牛津杯中，每個處理3個重復。接種后的平板繼續放在25 ℃生化培養箱中培養觀察，選出拮抗作用較為明顯的菌株，進行復篩試驗。

1.2.5 抗農業病害真菌農用抗生素活性菌株的復篩。采用初篩的方法，對初篩得到的具有抑菌活性的海洋細菌進行2～3次活性菌株復篩。在重復復篩過程中，加入空白對照，對照將200 μL細菌發酵液替換為200 μL無菌2216E培養基，其他條件和方法同“1.2.4”，排除試驗中其他因素對試驗結果的干擾。

1.2.6 發酵條件的優化。

在250 mL三角瓶中進行液體發酵，將一定量菌液接種于2216E培養基中，23 ℃、150 r/min條件下培養24 h。改變某一條件，并保持其他發酵條件不變，通過測量菌株的抑菌圈，研究裝液量、接種量及pH對農業病害真菌抑菌效果的影響。

1.2.6.1 裝液量對抑菌效果的影響。

將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，接種于裝有25、30、35、40 mL發酵培養基的250 mL三角燒瓶中，在150 r/min、pH 7.5～7.8、23 ℃條件下培養2 d，測定裝液量對油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳裝液量。

1.2.6.2 接種量對抑菌效果的影響。

分別按2%、4%、6%、8%、10%的接種量，將菌株接種于裝有30 mL發酵培養基的250 mL三角燒瓶中，在150 r/min、pH 7.5～7.8、23 ℃條件下培養2 d，測定接種量對油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳接種量。

1.2.6.3 pH對抑菌效果的影響。

將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，分別接種于裝有30 mL發酵培養基的250 mL三角燒瓶中，pH分別設5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在150 r/min、23 ℃條件下培養2 d，測定pH對油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳pH。

2 結果與分析

2.1 海洋細菌菌株的初篩結果

采用平皿拮抗法對99株海洋微生物菌進行農用抗真菌活性的初篩，該方法操作簡便，能夠直接觀察到微生物之間的拮抗作用，從而篩選出活性菌株。

在初篩中觀察到21株海洋細菌可能具有抑菌作用，供試菌對稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，ACCC 36028）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani，ACCC 36246）、 油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsic，ACCC 37049）5種病害菌的試驗結果見表1。

2.2 具有抗菌活性菌株的復篩結果 采用牛津杯法將初篩得到的21株活性海洋細菌進行進一步的抗菌試驗，對活性菌株進行活性復篩，得到3株具有抑菌效果的海洋細菌，然后測定其抑菌圈直徑。

由圖1可知，菌株MB025、MB026、MB133對油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）有明顯的抑菌效果，同時形成3個抑菌圈，用直尺測定直徑。由表2可知，菌株MB025、MB026、MB133對油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC 37700）的抑菌圈≥17 mm。

由圖2～4可知，菌株MB025、MB026和MB133對番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，ACCC 36028）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsic，ACCC 37049）都具有抑菌效果，但其抑菌效果不明顯，無法測量抑菌圈。MB133菌株對稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）抑菌效果明顯，其抑菌圈直徑為18.20 mm。

2.3 發酵條件優化

采用牛津杯法對初篩得到的21株活性海洋細菌進行復篩，發現菌株MB133的抑菌效果最明顯，故將MB133菌株進行發酵條件優化。

2.3.1 裝液量對菌株抑菌作用的影響。

裝液量的多少會影響發酵液中的溶氧。由圖5可知，12%的裝液量抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑為14.85 mm，以裝液量30 mL為最佳裝液量。

2.3.2 接種量對菌株抑菌作用的影響。

接種量主要影響的是發酵周期，大量地接種種子發酵液會使菌體迅速進入對數生長期，縮短了延滯期，從而縮短了發酵周期。當接種量過大時，會使菌體提前衰退，降低細胞濃度，影響發酵水平。由圖6可知，接種量為10%時，抑菌圈直徑最大為15.85 mm，當接種量為2%時，抑菌圈直徑為15.15 mm，以接種量2%為最佳接種量。

2.3.3 pH對菌株抑菌作用的影響。

發酵培養基初始pH對微生物的生長的影響較大，pH可能會影響菌體的生長和代謝產物的合成。由圖7可知，初始pH在7.0時抑菌效果最好，抑菌直徑為10.95 mm。

3 結論與討論

在初篩試驗過程中，共篩選到21株具有抑菌活性的海洋細菌。經過復篩試驗，發現有3株海洋細菌具有較強抑菌活性，分別是編號為MB025、MB026、MB133的海洋細菌，它們在油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum，ACCC37700）平板上具有較明顯的抑制作用，且菌株MB133對稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，ACCC 37631）的抑菌效果最明顯。這3株海洋細菌均在初篩和復篩平板上有較明顯的抑菌圈，所以確定其具有抗菌活性。另外，通過發酵條件優化得出，菌株MB133培養的最適pH為7.0，接種量為2%，裝液量為12%。該研究為農用抗生素的推廣和應用奠定了基礎，后續試驗將進行抑菌活性物質的分離、提取及鑒定。

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