高唐栝樓莖尖分生組織培養與快速繁殖技術研究

彭向前　李光勇　劉輝

摘要[目的]采用莖尖分生組織培養脫毒技術培育高唐栝樓的脫病毒試管苗。[方法]對添加不同濃度外源生長調節劑的培養基進行一系列優化試驗，篩選出高唐栝樓脫毒試管苗最佳繁殖培養基。[結果]在MS+2.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT培養基中誘導效果較好，技術上達到了快速繁殖規模生產的要求。經反復的病毒檢測，證明脫毒試管苗脫病毒徹底。[結論]最終獲得了高唐栝樓莖尖培養脫毒與誘導、增殖和生根的培養基，及其生長所需要的外部環境條件和相關配套技術。

關鍵詞高唐栝樓；脫毒；莖尖分生組織；組織培養；快速繁殖

中圖分類號S567.23文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0081-03

Technology System for Stemapex Meristem Culture and Rapid Propagation of Trichosanthes kirilowii Maxim.

PENG Xiangqian，LI Guangyong，LIU Hui et al

（College of Pharmaceutical Sciences，Liaocheng University，Liaocheng，Shandong 252059）

Abstract[Objective]Virusfree seedling in test tube of Trichosanthes kirilowii Maxim. was obtained from stemapex meristem culture in vitro. [Method]A series of optimization experiments for propagative medium composition and concentration of phytohormones were investigated with a view to accelerate the propagation of virusfree seedling in test tube of T. kirilowii Maxim. [Result]The most suitable rapid propagative medium of T. kirilowii Maxim. was MS+2.0 mg/L 6BA +0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT. These results could meet the technology requirements of rapid propagation in large scale production. Virusfree seedlings in test tube were tested repeatedly，which had no virus completely. [Conclusion]The cultural mediums of detoxification and induction，proliferation and rooting were obtained as well as the external environmental conditions for the plant growth and matching technology.

Key wordsTrichosanthes kirilowii Maxim.；Virusfree；Stemapex meristem；Tissue culture；Rapid propagation

高唐栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim.）為葫蘆科栝樓屬多年生攀緣草本植物，有潤肺化痰、養胃生津、利氣寬胸等作用[1]。高唐栝樓為山東省1種道地藥材，其個大質優，在國內外享有較高的知名度，近年來面積不斷擴大，而優質種苗卻供應不足。栝樓繁殖一般有種子繁殖和分根繁殖2種方法，但栝樓雌雄異株，且開花前無明顯的形態差異，難以分辨，種子繁殖后常出現雄株多（雌雄株比例約為 3∶7）的現象，影響了產量和經濟效益，而用分根繁殖，由于塊根本身屬于藥材，同時塊根繁殖量不大，且常年無性繁殖會引起種源退化嚴重，導致優質高唐栝樓種苗數量少[2]。

植物組織培養具有繁殖系數大、脫病毒復壯的優點[3]，組織培養方法應用在栝樓上已有報道，但有關高唐栝樓的組培研究鮮見報道。筆者采用高唐栝樓塊根誘導產生幼芽，對幼芽的莖尖分生組織進行培養得到大量的高唐栝樓脫毒試管苗，不僅提高了高唐栝樓的繁殖系數，而且提高了高唐栝樓的產量與質量。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為國家地理標志產品高唐栝樓，取株高唐栝樓根，并做好標記。

1.2方法

1.2.1

供試材料處理。選取無病害且飽滿健壯的雌株高唐栝樓根，用自來水將其沖洗干凈后，埋于干凈的砂土中，保持良好的通風環境，在（25±1）℃條件下進行催芽。待高唐栝樓根上的幼芽高度達1.0～1.5 cm時剝取長勢良好的幼芽，蒸餾水沖洗5次，置于45 ℃恒溫培養箱中處理5 min，進行脫毒。

將脫毒的幼芽用無菌水沖洗后置于75%乙醇溶液30 s，置于5%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，取出后用無菌水沖洗6次，置于4 ℃冰箱，備用。

1.2.2培養基對莖尖成苗的影響。取高唐栝樓莖尖分別接種于MS、B5和LS這3種培養基上誘導芽叢，3種培養基均不添加任何外源生長調節劑，計算成苗率，選擇培養基。

1.2.3

莖尖大小和成活率關系。剝取不同長度高唐栝樓莖，分別接種到初代培養基MS+ 0.5 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA，莖尖明顯變綠說明已經成活，比較莖尖大小和成活率的關系。

1.2.4

初代培養。配制初代培養基MS+0.5 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA，分裝于培養瓶后進行滅菌處理。取備用幼芽，借助解剖鏡剝取0.2～0.5 mm的莖尖作為組織培養的外植體，每瓶接種1個，用玻璃紙包扎好瓶口，置于人工氣候室，培養環境為光照強度1 500 lx，溫度（25±1）℃，光照時間12 h/d，并設置暗時溫度（18±1）℃。培養7 d后，觀察培養的莖尖明顯膨大，呈淺黃色，莖尖隨培養時間增長逐漸轉綠，20 d后莖尖呈翠綠色。

1.2.5

繼一代培養。初代培養20 d后就可以準備進行繼一代培養，誘導高唐栝樓幼芽分化，形成芽叢。在第25 天進行轉接，繼一代培養的培養基、光照和溫度等培養條件采用初代培養的條件。第45天大多數的幼芽高度可達2～3 cm，切下芽叢進行繼二代培養。

1.2.6

病毒檢測。從繼一代培養的芽叢上選擇1個幼芽，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）對其進行病毒檢測。根據檢測結果，選擇已完全脫去病毒的芽叢進行繼二代培養。

1.2.7

繼二代培養和繁殖培養基篩選試驗。高唐栝樓繼一代培養幼芽進行繼二代培養后，觀察到采用初始培養基培養的試管苗比較瘦弱，且易玻璃化，因此，對繁殖培養基的配比進行優化篩選。采用正交試驗L9（34），探討6-BA、NAA、KT這3種外源外源生長調節劑對培養效果的影響（表1）。

1.2.8

生根與煉苗。取高約1.5 cm的試管苗接種于生根培養基中進行生根，生根培養基等同于初代培養基。7 d后試管苗開始生根，待試管苗高度為5～6 cm、根為3～5條時，揭蓋煉苗，控制溫度（25±1）℃、相對濕度90%以上。為防止幼苗失水，在培養瓶中加少許清水，第1～3天瓶蓋半開半遮，第4天完全去掉瓶蓋。

1.2.9

移栽馴化。將煉苗后的試管苗取出，用清水沖去根上附著的培養基，用多靈1 000倍液蘸根，移栽到營養缽，置于戶外簡易人工氣候室苗床中進行馴化，第1～7天控制溫度（25±1）℃、相對濕度90%以上，第7天后，控制溫度在20～30 ℃，并逐漸加大通風量，降低濕度，同時增加自然光照強度和時間，使高唐栝樓幼苗逐漸適應自然環境。

2結果與分析

2.1不同培養基對莖尖成苗的影響

取高唐栝樓莖尖分別接種于MS、B5和LS這3種培養基上，誘導芽叢，3種培養基中均不添加任何外源生長調節劑，誘導結果見表2。3種培養基均能誘導芽叢的產生，成苗率為85.0%以上。在MS培養基中成苗率較高，且芽叢健壯，B5和LS這2種培養基中的芽瘦弱，且成苗率相對較低。因此，選擇MS作為主要培養基。

2.2莖尖大小和成活率關系

取備用的高唐栝樓幼苗，剝取不同長度的莖尖，分別接種到初始培養基，莖尖明顯變綠說明莖尖已經成活。莖尖大小和成活率的關系見表3。

高唐栝樓脫毒過程中，剝取的莖尖大容易成活，但相應的芽叢攜帶病毒的概率變大，達不到脫毒的效果；剝取的莖尖小攜帶病毒的概率降低，但成活率不高，主要由于過小的莖尖頂端含有細胞數目少，導致細胞進一步分裂分化的可能性小[4]。

0.2 mm以下的莖尖容易干枯死亡，且成活率低。經過比較莖尖大小和成活率的關系，發現剝取0.2～0.5 mm的莖尖分生組織培養可以取得較好的效果，因剝取的莖尖相對較小，容易脫水死亡，所以剝取莖尖動作要迅速。

2.3繁殖培養基的篩選

從表4可以看出，3種外源生長調節劑對試管苗平均生長率的影響大小為A（6-BA）、C（KT）、B（NAA）。A（6-BA）因素與試管苗生長率有極顯著意義（P<001），C（KT）因素與試管苗生長率有顯著意義（P<005），而B（NAA）因素與試管苗生長率沒有顯著意義，在正交試驗中9種培養基試管苗生長率最高為50.2%。優化篩選出高唐栝樓的最佳繁殖培養基為A2B1C3，即MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT，用篩選得到的最佳培養基進行高唐栝樓試管苗繼二代培養，試管苗比較健壯，沒有出現玻璃化苗，試管苗生長率為60.5%。

2.4脫毒高唐栝樓苗的病毒檢測

對移栽馴化成活后的高唐栝樓脫毒苗進行病毒檢測。檢測時隨機取樣，采集葉片1 g置于研缽中，加入10 mL水和5 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L）研磨，取液分別涂抹于葉片2～3次，用600目金鋼砂輕輕磨擦，5 min后用清水沖洗葉面，30 d后觀察葉片的發病情況[5]。檢測結果顯示，高唐栝樓脫毒苗的脫毒率為100%。

3結論與討論

該試驗以高唐栝樓莖尖作為外植體，采用莖尖分生組織培養脫毒技術，不經歷愈傷組織，一次性成苗，比經歷愈傷組織后再轉移到分化培養基生根發芽要快，還不會出現遺傳上的不穩定性和變異性，同時還能簡化育苗程序[6]，降低生產成本。該試驗通過高唐栝樓莖尖組織培養，建立了高唐栝樓快速繁殖體系，解決了高唐栝樓以種子繁育雌雄比例不協調的問題，可大量提供優質高唐栝樓組培苗，降低繁育成本，加速優質種苗的繁育進程[7]，同時對高唐栝樓種苗的品種更新及品種遺傳改良具有一定的指導意義。

外植體能否再生成功，在很大程度上取決于所選植物的基因型對培養基的適合程度。在培養基的選擇上，加入微量外源生長調節劑對莖尖分生組織發育有促進作用，可明顯提高高唐栝樓莖尖的成活率，但高濃度的細胞分裂素對芽叢的誘導有利，同時會抑制植物本身生長素的產生，這樣植株葉綠素等成分合成無法跟上植物細胞分裂的速度，會產生黃綠色略透明的玻璃化苗[8]。該研究在比較MS、B5、LS這3種培養基對莖尖成苗影響的基礎上確定了MS作為基礎培養基，并以較低濃度的6-BA、NAA和KT這3種外源生長調節劑的不同配比加入到MS培養基中進行正交試驗，最后篩選出的培養基得到了較好的培養效果。正交試驗方差分析表明，6-BA和KT這2種外源生長調節劑加入培養基對試管苗生長率的影響比較大，這表明不同基因型的植物對外源生長調節劑的敏感程度是不相同的，所以在培養基中加入外源生長調節劑時要有一定的選擇性。

參考文獻

[1] 李愛峰，張永清.栝樓的化學成分研究進展[J].安徽農業科學，2012，40（30）：14713-14716.

[2] 蔡宣梅，郭文杰，張潔，等.福建省道地瓜蔞組織培養體系的建立[J].福建熱作科技，2016，41（2）：1-3.

[3] 邵春月，高山林，陳峰，等.懷地黃分生組織培養脫病毒及快速繁殖技術的研究[J].藥物生物技術，2008，15（4）：258-261.

[4] 鄧才生.人參果脫毒培養與快速繁殖研究[J].云南農業科技，2009（2）：14-15.

[5] 馮果，曾志乾，吳增光，等.基于綜合評分法的不同產地加工方法對瓜蔞藥材質量的影響[J].安徽農業科學，2017，45（29）：120-123.

[6] 韓琳娜，聶金娥，周鳳琴，等.栝樓叢生芽快繁體系的建立[J].山東農業科學，2014，46（3）：46-48.

[7] 崔必波，王偉義，顧閩峰，等.瓜蔞套種麥子節本高產栽培技術初探[J].安徽農業科學，2015，43（28）：75-76，101.

[8] 馬維平，黃連超，顧紅衛，等.荊半夏組織培養及快速繁殖的研究[J].西北藥學雜志，2006，21（2）：57-59.