一株野生大型真菌的菌種分離及ITS序列鑒定

宋立志　馮連榮　梁德軍　矯麗曼　張妍

摘要 [目的]尋找適宜楊樹林下栽培的野生食用菌菌種。[方法]對采集自遼寧省阜新市蒙古族自治縣銀中楊林下的野生大型真菌進行菌種分離，同時研究不同分離部位對菌絲生長的影響，并對獲得菌絲進行了rDNA ITS序列分析。[結果]菌蓋與菌柄連接處為菌種最佳分離部位。對分離株rDNA ITS 片段進行PCR擴增，擴增產物長度為692 bp，登錄NCBI與GenBank中已知的菌種進行Blast比對，序列與Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc的Query cover為97%～100%，ident均為99%。[結論]鑒定分離菌種為蘑菇科、蘑菇屬、大肥菇。該研究可為下一步開展楊-食用菌復合經營提供菌種準備。

關鍵詞 楊樹；野生大型真菌；菌種分離；ITS序列鑒定；大肥菇

中圖分類號 S718.81 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）14-0113-03

Isolation and Identification of ITS Sequences of a Wild Macrofungi

SONG Lizhi， FENG Lianrong， LIANG Dejun et al

（Liaoning Institue of Poplar，Gaizhou， Liaoning 115213）

Abstract [Objective]To find suitable strains of wild edible fungi cultivated under poplar forests. [Method]Wild macrofungus under Populus alba forest collected from Mongolia Autonomous County， Fuxin City， Liaoning Province was isolated and the effects of different separation sites on mycelium growth were studied. The rDNA ITS sequences of mycelium were studied.[Result]The junction between the cap and stipe was the best separation site for the fungus. The rDNA ITS fragment was amplified by PCR， the length of the amplified product was 692 bp. The Blast comparison was performed between NCBI and a known strain in GenBank. The Query cover between sequence and Agaricus bitorquis（Quél.） Sacc was 97% to 100%， the idents were all 99%.[Conclusion]The identified strains belong to mushroom family， mushroom genus and Agaricus bitorquis.The study can provide the preparation of strains for the nest stage of poplaredible fungus compound management.

Key words Poplar；Wild macrofungi；Isolation of strains；ITS sequence identification；Agaricus bitorquis

我國是世界上楊樹人工林面積最大的國家[1]，其中遼寧省是我國楊樹發展的重要省份之一。但楊樹生產周期長、見效慢，直接經濟效益來得晚而且很低，因此如何搞好林地綜合開發利用、找到林業經濟增長點，是黨和各級政府關心的問題。近年來楊-糧[2-4]、楊-草[5-6]、楊-食用菌[7-10]等復合經營成為楊樹產業發展的重要方向。食用菌作為一種傳統林副產品，非常適合林下栽培，成本低、收益高，楊-食用菌復合經營近年來備受青睞。

根據林地條件，篩選適宜林下栽培的食用菌菌種，是林下食用菌栽培技術的重要組成部分，也是決定林下栽培食用菌成功與否的首要因素[11]。平原地區楊樹林下受環境條件限制，野生食用菌資源種類、數量遠不及山區，所以尋找適宜楊樹林下栽培的食用菌品種至關重要。筆者從銀中楊林下采集一種野生大型真菌，對菌種進行分離及鑒定，為下一步開展楊-食用菌復合經營提供菌種準備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。

供試大型真菌子實體于2016年5月12日采自遼寧省阜新市阜新蒙古族自治縣銀中楊（Populus alba×P.berolinensis）樹下。阜新蒙古族自治縣氣候屬北溫帶半干旱季風大陸性氣候區；多年平均日照數為2 865.5 h，年均氣溫7.2 ℃，≥10 ℃活動積溫3 298.3 ℃，有效積溫1 607.3 ℃，無霜期150 d左右；年平均降水量500 mm左右，5—9月份降水量425 mm，占全年的85%。

1.1.2 培養基。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，水1 000 mL，pH自然。稱取馬鈴薯200 g并切成1 cm2的小塊，放入水中煮沸20～30 min，用八層紗布進行過濾，過濾后加入葡萄糖、瓊脂，繼續加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補足水分至1 000 mL，分裝錐形瓶，121 ℃、0.15 MPa高壓滅菌20 min，備用。

1.1.3 酶及生化試劑。

Taq DNA 聚合酶，購自Thermo公司；TIANGEN DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列為

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離。

將采集的子實體用75%乙醇輕輕擦拭2～3遍，在超凈工作臺中，將子實體沿菌蓋中央輕輕掰開，用解剖刀分別在子實體菌柄、菌蓋及菌柄與菌蓋交界處取6 mm左右的菌肉接種至PDA平板培養基中，每個平皿接種1塊菌肉，重復5次，用封口膜封口后于25 ℃條件下培養，每天觀察菌絲生長情況。當有菌絲長滿平皿時結束培養，采用十字交叉法測量菌絲直徑，計算菌絲日均生長速度（mm/d）。

1.2.2 菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測。

將分離得到的菌種命名為FM512，接種到PDA平板培養基中，25 ℃下靜置培養7 d后，刮取菌落邊緣的新鮮菌絲，使用DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取，具體操作按說明書進行，將提取的DNA置于-20 ℃保存備用。取6 μL提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Syngene G：BOX凝膠成像系統進行拍照。

1.2.3 ITS-PCR擴增及序列比對。

以基因組DNA為模板，應用真菌通用引物對ITS1和ITS4進行PCR擴增，ITS-PCR擴增體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物（10 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補足至25 μL。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min，終止溫度為4 ℃。反應結束后取6 μL產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司進行測序。測序結果登錄GenBank進行Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）比對。

2 結果與分析

2.1 子實體形態特征

對采集的子實體形態特征（圖1）描述如下：子實體大，菌蓋直徑7.5 cm，扁半球形，頂部略下凹，白色；邊緣內卷，無鱗片；菌肉白色，厚，緊密，菌褶白色，后變粉紅色到黑褐色，離生，不等長；菌柄短，粗壯，5.0 cm×3.0 cm，白色，內實，近圓柱形；菌環雙層，白色，膜質，生菌柄中部；孢子印深褐色，孢子褐色。

2.2 子實體不同部位對分離的影響

將FM512從子實體的不同部位進行分離培養，3個部位的菌絲在生長速度上有一定差異（表1），其中菌柄菌蓋交界處菌絲生長快于菌蓋、菌柄處，3個處理菌絲長勢和菌絲濃密程度差異不大（圖2）。

2.3 菌絲DNA提取及ITS-PCR擴增

將提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖3），DNA條帶清晰、較明亮，無明顯后拖尾現象，說明基因組DNA完整，可以作為PCR反應的模板。以DNA為模板，ITS1、ITS4為引物對rDNA ITS區段PCR擴增，結果顯示片段大小約為700 bp（圖4），與預期結果一致。

2.4 序列比對

rDNA ITS區段序列測定結果顯示，PCR擴增產物長度為692 bp，測序結果登錄NCBI經Blast比對，結果表明，與FM512相似性最高前10位的菌株均為Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc，Query cover為97%～100%，ident均為 99%，確定FM512為Agaricus bitorquis（大肥菇）。

3 結論與討論

對于野生食用菌的鑒定，判斷所獲得無性培養菌絲是否是從原子實體分離獲得，單從菌絲的形態不能完全準確進行判斷。隨著分子生物學技術的發展，國際核酸庫信息資源不斷豐富，ITS等分子鑒定手段逐漸被人們關注。將ITS序列與GenBank數據庫進行Blast檢索比對，序列相似性≥99%，可以鑒定為相同種[12]。筆者對采自阜新蒙古族自治縣銀中楊林下的野生大型真菌FM512進行了組織分離，適宜分離部位菌蓋和菌柄交界處優于菌蓋、菌柄處。對獲得的菌絲進行了ITS-PCR擴增，經序列比對鑒定FM512為大肥菇，屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricales）、蘑菇科（Agaricaceae）、蘑菇屬（Agaricus）。

參考文獻

[1] 蔣建科.我國楊樹人工林面積超1億畝居世界之首[EB/OL].（2015-01-22）[2018-02-10].http：//scitech.people.com.cn/n/ 2015/0122/c1007-26430850.html.

[2] 袁玉欣，魏宏俠，馬榮澤，等.楊糧間作系統農作物產量研究[J].河北林果研究，2001，16（1）：7-13.

[3] 孫啟祥，韋朝領.不同林齡林分對間作物產量的影響[J].安徽農業大學學報，2000，27（2）：146-149.

[4] 王穎，袁玉欣，魏紅俠，等.楊糧間作系統小氣候研究[J].中國生態農業學報，2001，9（3）：40-42.

[5] 安樹青，張久海，陳興龍，等.江蘇海岸帶林草復合生態技術及其效應研究[J].林業科學，2001，37（2）：21-28.

[6] 陳光玲，鎖一兵.楊樹和牧草間作模式及栽培技術[J].林業實用技術，2002（1）：25.

[7] 張志玲，王迎，李寧，等.楊樹速生豐產林林菌復合高效栽培模式研究[J].山東林業科技，2013（5）：35-38.

[8] 冀永杰，牛貞福，國淑梅.林地雞腿菇高產優質栽培模式研究[J].北方園藝，2007（3）：204-205.

[9] 遲全勃，劉憲東，遲全元，等.雞腿菇楊樹林地仿野生栽培技術[J].中國農技推廣，2012，28（5）：28-30.

[10] 徐洪海.速生林套種雞腿菇仿野生栽培技術[J].食用菌，2009，31（4）：53-54.

[11] 張婧，杜阿朋.我國林下食用菌栽培管理技術研究[J].桉樹科技，2014，31（4）：55-60.

[12] LANDEWEERT R，LEEFLANG P，KUYPER T W，et al.Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons[J].Applied and environmental microbiology，2003，69（1）：327-333.