PFT—α對雞傳染性喉氣管炎病毒侵染宿主細胞的影響

孫邦耀 邵昱昊 高琦 李海 劉勝旺

摘要[目的]研究抑癌基因p53小分子抑制劑PFT-α對ILTV侵染宿主細胞的影響。[方法]用PFT-α處理LMH（雞肝癌細胞），通過結晶紫染色技術檢測細胞感染ILTV 24 h后的細胞死亡情況，通過流式細胞術檢測PFT-α對ILTV吸附、進入LMH細胞的影響，通過倒置熒光顯微鏡和高內涵細胞篩選系統檢測PFT-α對ILTV在細胞間擴散的影響。[結果]結晶紫染色表明，PFT-α促進了ILTV感染后的細胞死亡，流式細胞術結果表明，PFT-α對ILTV吸附細胞沒有影響，但是促進了ILTV進入細胞。同時，倒置熒光顯微鏡和高內涵細胞篩選系統檢測結果表明，PFT-α對ILTV在細胞間擴散沒有影響。[結論]研究初步檢測了PFT-α對ILTV侵染LMH細胞過程的影響，為進一步研究ILTV與宿主互作過程提供了理論補充。

關鍵詞傳染性喉氣管炎病毒；病毒吸附；病毒進入；病毒擴散

中圖分類號S852.65文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）05-0087-04

Abstract[Objective]To research the effect of PFTα， a p53 inhibitor， on laryngotracheitis virus（ ILTV） infecting host cells.[Method]In present study， we detected the effect of PFTα on cell death， ILTV binding and penetration as well as transmission between LMH cells by stained with 0.1% crystal violet， flow cytometry and observing expression of EGFP using fluorescence microscopy and Operetta CLS highcontent analysis system. [Result]Crystal violet staining result showed that PFTα promoted LMH cells death after ILTV infection. Flow cytometry results showed that PFTα had no effect on viral binding but promoted penetration of ILTV. Results of both fluorescence microscopy observation and Operetta CLS highcontent analysis system showed that PFTα had no effect on ILTV transmission between LMH cells. [Conclusion]Our findings have advanced our understanding about how ILTV infection host cells and provided another promising option for controlling AILT.

Key wordsInfectious laryngotracheitis virus；Virus binding；Virus penetration；Virus transmission

雞傳染性喉氣管炎（avian infectious laryngotracheitis，AILT）是雞的一種高度接觸性傳染病，其臨床癥狀主要包括呼吸困難、咳嗽和產蛋下降等[1]。該病于1925年被首次報道于美國，目前分布于世界各地[2]。AILT的病原為傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV），屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α亞科（Alphaherpesvirinae）中的雞皰疹病毒1型（Gallid herpesvirus 1）[3]。ILTV為線性雙股DNA囊膜病毒，直徑為195～250 nm。

和其他α皰疹病毒一樣，ILTV在急性入侵上呼吸道后會潛伏于神經系統內，從而逃避宿主免疫監視，當宿主免疫力低下時ILTV又從潛伏狀態中激活，造成疫情暴發。當前，AILT防疫主要依靠接種減毒活疫苗所產生的免疫應答，但給雞群注射減毒活疫苗時也存在散毒的風險，引起機體潛伏感染，從而逃避宿主免疫監視，使得清除困難[4]，因此難以長效地防制AILT。研究ILTV侵染宿主細胞的過程能幫助人們更深入地理解ILTV的傳播與致病機理[5]，從而為AILT的防制提供新的思路。有研究表明，在ILTV感染機體的過程中，細胞免疫應答而非體液免疫應答起到決定性作用[6]，因此研究ILTV在細胞間的擴散顯得尤為重要。該研究通過結晶紫染色、流式細胞術、倒置熒光顯微鏡以及高內涵細胞篩選系統檢測了抑癌基因p53小分子抑制劑PFT-α對ILTV吸附和進入LMH細胞、ILTV在LMH細胞間擴散以及ILTV感染后的細胞死亡的影響，以期為研究ILTV侵染宿主過程提供試驗基礎，也為完善現有AILT防控體系提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料與試劑

LMH細胞（雞肝癌細胞）、抗ILTV gI糖蛋白多克隆抗體、帶GFP標簽的病毒株ILTV-EGFP為哈爾濱獸醫研究所禽呼吸道病創新團隊實驗室保存；ILTV-EGFP的TCID50為10-4.56/0.1 mL；0.1%結晶紫染色液、紅色熒光染料Dil、R18及生物活性小分子PFT-α、FITC標記的抗兔二抗均購自于Sigma公司；0.1 μm PVDF膜濾器購自于美國Millipore公司；所用離心機為Allegra X-15R臺式冷凍離心機（美國，Beckman Coulter）。

1.2結晶紫染色

以ILTV感染復數（病毒感染復數=感染性病毒顆粒/被感染細胞數，感染性病毒顆粒以PFU計算，PFU= TCID50×0.69[7]，下同）為0.1的劑量接種LMH細胞，并分別在ILTV感染前后各以PFT-α（20 μmol/L）處理細胞，對照組為相同體積的DMSO，待各個處理組細胞死亡現象在肉眼觀測下差異明顯時進行結晶紫染色，棄去細胞上清，用70%乙醇室溫固定30 min，棄掉固定液待室溫下風干后用0.1%的結晶紫細胞室溫染色40 min，之后回收結晶紫染色液，用PBS洗去細胞表面殘留的染色液，室溫風干后拍照。

1.3病毒制備

待T25細胞瓶中LMH細胞長滿單層后接種ILTV-EGFP，MOI為0.1，待細胞病變達70%以上時將細胞在-80 ℃下反復凍融3次以充分釋放病毒，將病毒液以12 000 r/min離心10 min，取病毒上清分別用Dil（3 μmol/L）和R18（3 μmol/L）染色，室溫下避光孵育20 min，然后用0.1 μm 的PVDF膜濾器過濾病毒液，此時病毒滯留在濾膜上，再用2 mL左右無血清培養基沖洗濾器，最后將濾器置于無血清培養基中往回倒抽以回收病毒，病毒液過濾體積∶病毒液回收體積為 2∶1。

1.4PFT-α對ILTV吸附細胞影響的檢測

將PFT-α對ILTV吸附細胞的影響采取兩種方法進行檢測。方法一：待24孔板中LMH細胞長滿單層后接種PFT-α（20 μmol/L），對照組為相同體積的DMSO，孵育12 h后用胰酶消化細胞，1 200 r/min離心5 min收集細胞，棄掉上清后加入500 μL Dil染色后回收的病毒液，將細胞懸起混勻，置于4 ℃內讓病毒避光吸附1 h，之后1 200 r/min離心5 min收集細胞，棄掉上清后加入500 μL PBS重懸細胞并過300目銅篩網置樣品于流式細胞管中待測。

方法二：待24孔板中LMH細胞長滿單層后接種PFT-α（20 μmol/L），對照組為相同體積的DMSO，孵育12 h后用胰酶消化細胞，1 200 r/min離心5 min收集細胞，棄掉上清后加入500 μL未染色的病毒液，將細胞懸起混勻后置于4 ℃內讓病毒吸附1 h，之后1 200 r/min離心5 min收集細胞，棄掉上清后加入1%BSA稀釋的抗ILTV gI糖蛋白的兔多克隆抗體，gI抗體∶1%BSA=1∶10，以兔IgG作為對照，4 ℃孵育1 h后1 200 r/min離心5 min收集細胞，棄掉上清后加入1% BSA稀釋的FITC標記的抗兔二抗，二抗稀釋比例為1∶300，4 ℃內避光孵育30 min后1 200 r/min離心5 min收集細胞，棄掉上清后加入500 μL PBS重懸細胞并過300目銅篩網置樣品于流式細胞管中待測。

1.5PFT-α對ILTV進入細胞影響的檢測

待24孔板中LMH細胞長滿單層后棄掉上清，用無血清培養基輕輕洗掉細胞表面殘留的血清，加入500 μL R18染色后回收的病毒，置于4 ℃讓病毒避光吸附1 h，之后加入PFT-α（20 μmol/L），對照組為DMSO，在4 ℃內孵育1 h后轉移至37 ℃、5%CO2培養箱內孵育1 h讓病毒進入細胞，待病毒充分進入后收集細胞，用流式細胞儀檢測病毒進入情況。

1.6PFT-α對ILTV在細胞間擴散影響的檢測

以MOI為1的劑量給24孔板中長滿單層的LMH細胞接種ILTV-EGFP，待病毒充分進入后將細胞消化離心，將此感染細胞與另外未感染病毒的LMH細胞混勻后共同接種96孔板（6孔板），兩者比例為1∶50，待細胞貼壁后加入PFT-α（20 μmol/L）及DMSO，并且在細胞表面鋪一層低熔點瓊脂糖凝膠，另一組不鋪膠作為對照，之后于6、18和24 h在高內涵細胞篩選系統（倒置熒光顯微鏡）下檢測EGFP熒光表達情況。

2結果與分析

2.1PFT-α對細胞感染ILTV后細胞死亡的影響

以ILTV感染復數為0.1的劑量接種LMH細胞，并分別在ILTV感染前后各以PFT-α（20 μmol/L）處理宿主細胞，對照組為DMSO，在病毒感染24 h后做結晶紫染色。結果如圖1所示，和對照組相比，PFT-α處理組細胞死亡明顯更多，說明PFT-α促進了ILTV感染后的細胞死亡。

2.2PFT-α對ILTV吸附細胞的影響

用PFT-α孵育LMH細胞后用Dil預染的ILTV吸附細胞，流式細胞術結果顯示，和對照組相比，PFT-α處理組的Dil熒光密度均值（MFI）沒有顯著變化（P>0.05），這表明PFT-α對ILTV吸附細胞沒有影響（圖2a）；應用抗ILTV gI糖蛋白的兔多克隆抗體的方式通過流式細胞術進行檢測，也得到了相似的結論（圖2b）。綜上所述，PFT-α對ILTV吸附細胞沒有影響。

2.3PFT-α對ILTV進入細胞的影響

在對LMH細胞接種R18預染的病毒后，先使病毒在4 ℃條件下吸附1 h，然后添加PFT-α并4 ℃孵育1 h，之后將細胞轉移至37 ℃、5%CO2培養箱內讓R18預染的病毒進入細胞。流式細胞術結果顯示，和對照組相比，PFT-α處理組R18的熒光密度均值顯著增加（P<0.05）。以上結果說明，PFT-α促進了ILTV進入細胞（圖3）。

2.4PFT-α對ILTV在細胞間擴散的影響

ILTV在細胞間以2種方式進行擴散，即游離擴散和細胞-細胞間擴散，禽呼吸道病實驗室分別對2種方式進行了檢測。按照“1.5”中的方法操作，待混合培養的感染細胞與未感染細胞在96孔板（6孔板）內貼壁后，通過在LMH細胞表面添加低熔點瓊脂糖凝膠的方式阻斷病毒在細胞上清中的游離擴散，然后通過觀察EGFP熒光信號來檢測PFT-α對ILTV在細胞-

細胞間擴散的影響，同時通過高內涵細胞篩選系統統計病毒感染后不同時間點的EGFP熒光面積。結果顯示，隨著病毒感染時間的推移，EGFP表達逐漸增多，但和對照組相比，PFT-α對EGFP的表達沒有顯著影響（P>0.05，圖4a和b）。結果表明，PFT-α對ILTV在細胞-細胞間擴散沒有影響；另外，在未加低熔點瓊脂糖凝膠的共培養系統里，病毒以2種方式進行擴散。觀察結果表明，PFT-α對EGFP的表達也沒有顯著影響（P>0.05，圖5a和b）。綜上所述，PFT-α對ILTV的游離擴散和細胞-細胞間擴散均沒有影響。

3討論

AILT每年都會給世界養禽業造成巨大的經濟損失。目

前，疫苗接種仍然是防控AILT的主要措施，它能有效地防止ILTV感染。但和強毒株一樣，疫苗毒也會引起雞群潛伏感染[8]，從而逃避宿主免疫監視，使AILT反復暴發，很難根除。因此探索一種更為安全有效的AILT防控新策略至關重要。

研究ILTV與宿主之間的相互作用尤其是ILTV的傳播機制至關重要，它可以幫助人們更好地理解ILTV的復制、毒力和發病機理，并為完善現有AILT防控體系提供了新的切入點。病毒吸附、病毒進入和病毒在細胞間擴散是病毒侵染宿主細胞的重要步驟。病毒吸附和病毒進入是病毒侵染宿主細胞的初始環節，而病毒在細胞內復制后通過擴散去感染新的宿主細胞。在體內病毒主要以2種方式進行擴散，即游離擴散和細胞-細胞間擴散。游離擴散是指病毒在感染細胞內大量復制后釋放至外周環境中，然后借助外周環境進行遠端擴散；細胞-細胞間擴散指病毒借助細胞間形成的通道進行擴散。和細胞-細胞間擴散相比，游離擴散很容易被體液中的中和抗體所阻斷，不利于病毒的存活[9-10]。目前，關于人皰疹病毒1型和牛皰疹病毒1型在宿主細胞間擴散的研究均有報道[11-14]，然而，關于ILTV在細胞間擴散的研究知之甚少。此外，有研究表明，宿主Src（原癌基因酪氨酸激酶）作為主要調節因子調控ILTV感染過程[15]，但該研究并未闡明Src調控ILTV在宿主細胞間傳播的具體機制。該研究中，以ILTV感染LMH細胞為體外研究模型，初步探討了抑癌基因p53小分子抑制劑PFT-α對ILTV侵染宿主細胞的影響。通過結晶紫染色發現，PFT-α促進了ILTV感染后的細胞死亡。通過對ILTV進行Dil染色和應用抗ILTV gI糖蛋白抗體2種方式檢測，該研究發現PFT-α對ILTV吸附細胞沒有影響。通過R18染色的方式對ILTV進入宿主細胞的影響進行檢測。R18是一種二聚體小分子紅色熒光染料，此時本身熒光自淬滅。當標記有R18染料的ILTV囊膜與細胞膜發生融合時，R18在細胞膜上隨著細胞膜的流動被稀釋成單體，可以產生熒光信號，直接反映病毒進入宿主細胞的能力。流式細胞術結果指出，PFT-α可促進ILTV進入細胞。通過觀察和統計感染細胞和未感染細胞共培養系統里的EGFP熒光表達情況表明，PFT-α對ILTV的游離擴散和細胞-細胞間擴散均沒有影響。該研究結果提示，可通過改變ILTV侵染宿主細胞的環節來影響病毒的致病過程。該研究為研究ILTV侵染宿主過程提供了試驗基礎，也為完善現有AILT防治體系提供了新的思路。

參考文獻

[1] DAVISON A J.Herpesvirus systematics[J].Vet Microbiol，2010，143（1/2）：52-69.

[2] JOHNSON D C，MAXFIELD B G.An occurrence of avian influenza virus infection in laying chickens[J].Avian Dis，1976，20（2）：422-424.

[3] MCGEOCH D J，RIXON F J，DAVISON A J.Topics in herpesvirus genomics and evolution[J].Virus research，2006，117（1）：90-104.

[4] KOTIW M，WILKS C R，MAY J T.The effect of serial in vivo passage on the expression of virulence and DNA stability of an infectious laryngotracheitis virus strain of low virulence[J].Veterinary microbiology，1995，45（1）：71-80.

[5] VOEVODIN A F，MARX P A.Principles of virology[M].Washington DC：ASM Press，2004：471-472.

[6] COPPO M J C，HARTLEY C A，DEVLIN J M.Immune responses to infectious laryngotracheitis virus[J].Developmental & comparative immunology，2013，41（3）：454-462.

[7] WULFF N H，TZATZARIS M，YOUNG P J.Monte Carlo simulation of the SpearmanKaerber TCID50[J].J Clin Bioinforma，2012，2（1）：2-5.

[8] OU S，GIAMBRONE J J，MACKLIN K S.Infectious laryngotracheitis vaccine virus detection in water lines and effectiveness of sanitizers for inactivating the virus[J].Journal of applied poultry research，2011，20（2）：223-230.

[9] MOTHES W，SHERER N M，JIN J，et al.Virus celltocell transmission[J].J Virol，2010，84（17）：8360-8368.

[10] SATTENTAU Q.Avoiding the void：Celltocell spread of human viruses[J].Nat Rev Microbiol，2008，6（11）：815-826.

[11] ZHU L Q，YUAN C，HUANG L Y，et al.The activation of p38MAPK and JNK pathways in bovine herpesvirus 1 infected MDBK cells[J].Veterinary research，2016，47（1）：91.

[12] SAYERS C L，ELLIOTT G.Herpes simplex virus 1 enters human keratinocytes by a nectin1dependent，rapid plasma membrane fusion pathway that functions at low temperature[J].J Virol，2016，90（22）：10379-10389.

[13] DOCEUL V，HOLLINSHEAD M，VAN DER LINDEN L，et al.Repulsion of superinfecting virions：A mechanism for rapid virus spread[J].Science，20103，27（5967）：873-876.

[14] DINGWELL K S，BRUNETTI C R，HENDRICKS R L，et al.Herpes simplex virus glycoproteins E and I facilitate celltocell spread in vivo and across junctions of cultured cells[J].Journal of virology，1994，68（2）：834-845.

[15] LI H，WANG F J，HAN Z X，et al.Genomewide gene expression analysis identifies the protooncogene tyrosineprotein kinase Src as a crucial virulence determinant of infectious laryngotracheitis virus in chicken cells[J].J Virol，2015，90（1）：9-21.