金華佛手精油納米乳制備及其對HT—29細胞體外增殖的抑制作用

孫小涵 寇興然　呂文平　王洪新

摘要 [目的]研究制備佛手精油納米乳的工藝及納米乳對HT-29細胞增殖的抑制作用。[方法]以佛手精油和MCT混合為油相，吐溫（Tween-80）為表面活性劑，通過高壓均質法制備佛手精油納米乳（O/W型），并探討納米乳對HT-29細胞增殖的抑制作用。以粒徑大小和多分散性指數（PDI）為指標優選高壓均質法參數，采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測納米乳對細胞增殖的抑制影響。[結果]油相質量百分比10%（佛手精油和MCT質量比4 ∶1），乳化劑的質量百分比2.00%，在均質壓力10 000 Psi，均質次數3次的工藝條件下，得到的佛手精油納米乳粒徑為100～120 nm，PDI在0.3以下。[結論]佛手精油納米乳對HT-29細胞增殖有明顯抑制效果，且呈劑量依賴型。

關鍵詞 佛手精油；納米乳；抑制

中圖分類號 S-3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）18-0144-06

Preparation of Jinhua Fingered Citron Essential Oil Nanoemulsion and Its Inhibitory Effect on Proliferation of HT29 Cells in vitro

SUN Xiaohan1，2，KOU Xingran1，2， L Wenping1，2 et al

（1. The State Key Laboratory of Food Science & Technology，Wuxi，Jiangsu 214000；2. School of Food Science & Technology， Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214000）

Abstract [Objective]To study the process of preparing fingered citron essential oil nanoemulsion，and the inhibitory effect of nanoemulsion on the proliferation of HT29 cells.[Method]This article studied the process of preparing fingered citronessential oil nanoemulsion （O/W type） by highpressure homogenization， using fingered citron essential oil and MCT mixed as oil phase and Tween80 as surfactant. The inhibitory effect of nanoemulsion on the proliferation of HT29 cells was explored. The parameters of highpressure homogenization method were used as the index of particle size and PDI， and the inhibitory effect of nanoemulsion on cell proliferation was detected by MTT assay. [Result]The mass percentage of oil phase was 10% （mass ratio of fingered citron essential oil and MCT was 4 ∶1）， the mass percentage of emulsifier was 2.00%， and it was obtained under the conditions of homogeneous pressure of 10 000 Psi and 3 times of homogenization.The fingered citron essential oil nanoemulsion had a particle size of 100-120 nm and a PDI less than 0.3.[Conclusion]The fingered citron essential oil nanoemulsion significantly inhibited the proliferation of HT29 cells in a dosedependent manner.

Key words Fingered citron essential oil；Nanoemulsion；Inhibition

佛手（fingered citron），學名Citrus medica L.var.Sarcodactylis Swingle，又名佛手香櫞、蜜柑、蜜羅柑、福壽柑、五指柑等，屬蕓香科柑橘屬香櫞的變種，為常綠小喬木或灌木[1]。金華佛手主產于金華市赤松鎮山口等地，其果揮發油含量高達1.6%，所得揮發油為無色透明液體，芳香撲鼻，香氣極為濃郁。有研究表明，佛手精油主要成分是萜烯類、倍半萜烯類以及高級醇類、醛類、酮類、酯類等多種生理活性物質，具有較高的藥用價值，具有祛痰、止咳、平喘、抗焦慮、抗菌消炎和去除自由基等作用[2]。現代藥理學研究表明，植物精油具有廣泛的藥理活性，可有效抑制肝癌、子宮頸癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌、人白血病細胞、人卵巢癌細胞等多種癌細胞增殖，是一類具有開發價值的抗腫瘤中藥[3-6]。

植物精油常溫下不穩定，易揮發，在水中的溶解度極低。在儲藏過程中散失，導致其活性降低，該試驗選擇納米乳為基質，以提高其穩定性和溶解度，且制備過程在室溫下進行，有效地降低了精油損耗，從而達到緩釋的目的。

納米乳是一種液相以液滴形式分散于第二相的膠體分散體系，屬于非熱力學穩定體系，顆粒粒度為50～200 nm[7-8]。納米乳因其納米級粒徑可防止聚集和重力引起的乳液分離，具有抗沉降和乳析的動力學穩定特性，精油納米級乳化體系可以提高精油的水溶性、穩定性和生物利用度[9]。筆者研究了佛手精油納米乳的制備工藝及其對HT-29細胞體外增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮金華佛手（浙江金手寶生物科技有限公司）；聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯（Tween-80）（化學純，上海國藥集團）；磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、無水硫酸鈉、二甲基亞砜（分析純，上海國藥集團）；亞甲基藍、蘇丹紅（指示劑，上海國藥集團）；中鏈甘油三酯（MCT，上海慈太龍實業有限公司）；人結腸癌細胞株HT-29（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）；綿羊血（無菌，杭州新銳生物工程有限公司）；RPMI-1640 基礎培養基、青霉素/鏈霉素溶液、胎牛血清（美國Gibco公司）；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）。

1.2 儀器與設備

納米粒度及Zeta電位分析儀（Zetasizer nano ZS）（英國馬爾文公司）；高速剪切機（德國IKA公司）；NanoFast-15A型高壓均質機（MORGEC公司）；HZT-A600型電子天平（福州華志科學儀器有限公司）；JEM-2010HT透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；DG250小型厭氧工作站（英國DWS公司）；生物安全柜（美國Labconco公司）；BD150L三氣培養箱（德國Bingd公司）；PYX-DHS隔水式恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；磁力攪拌器（德國IK-A公司）；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋公司）；通風櫥（上海飛域公司）；Leica DM2000顯微鏡（德國Leica光學儀器公司）；HEPA Class 100型細胞培養箱（美國賽默飛公司）；UV-2100紫外可見分光光度計（優尼科上海有限公司）；5242R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；細胞培養板（美國Corning公司）；DK-S12恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；SP-250生化培養箱（南京實驗儀器廠）。

1.3 佛手精油的制備

稱取適量的成熟新鮮金華佛手，洗凈切塊，經高速組織搗碎機破碎后轉移至燒瓶中，加入適量的去離子水，加入沸石，連接揮發油測定器與回流冷凝管。用電熱套緩緩并保持微沸約4 h。收集精油，加入適量的無水硫酸鈉，在6 000 r/min、4 min、25 ℃的條件下離心進行油水分離，即可得到佛手精油產品。

1.4 佛手精油納米乳的制備

將MCT和佛手精油按比例混合即為油相，向其中加入適量的Tween-80，混合均勻后將混合液倒入磷酸緩沖液（pH=7，0.5 mmol）中，使樣品總質量達50 g。用高速剪切機10 000 r/min剪切5 min，得粗乳，使用高壓均質機10 000 Psi，均質3次，即得佛手精油納米乳。

1.5 佛手精油納米乳的質量評價

1.5.1 佛手精油納米乳類型的鑒定。

通過染色法[10]鑒定納米乳類型。分別將油溶性的蘇丹紅溶液和水溶性的亞甲基藍溶液滴到制備好的納米乳中，觀察2種染色劑在納米乳中的擴散速度，如果蘇丹紅的擴散速度大于亞甲基藍，該乳液為油包水型（W/O）；如果亞甲基藍的擴散速度大于蘇丹紅，該乳液為水包油型（O/W）；二者擴散速度相同則為雙連續型。

1.5.2 佛手精油納米乳形態觀察。

取適量的佛手精油納米乳樣品，用磷酸緩沖液稀釋100倍后，滴加在覆蓋碳膜的銅網上，用質量分數為 2.0%的磷鎢酸負染30 s，自然揮干，在透射電鏡下觀察納米乳的形態[11]。

1.5.3 佛手精油納米乳的穩定性。

將制備好的納米乳裝入玻璃瓶中，密封，在4、25、40 ℃的條件下，放置0、5、10 d，取適量稀釋后的納米乳于離心管中，15 000 r/min離心20 min，觀察是否出現絮凝、聚結、分層絮凝現象。

1.6 佛手精油納米乳抑制HT29細胞體外增殖作用

1.6.1 細胞培養。

將HT-29細胞加凍存液保存于液氮（-196 ℃）中。復蘇時，置于細胞培養瓶中，加入RPMI-1640細胞完全培養液，于5%CO2培養箱中37 ℃培養，每2 d換液1次，當細胞融合至70%～80%，用0.25%胰酶-EDTA消化傳代，細胞貼壁生長，通常2 d更換培養液，4 d進行傳代，傳代5次左右進行試驗。

1.6.2 精油及其納米乳對HT-29細胞形態學影響的觀察。

將生長融合至70%～80%的HT-29細胞進行消化，調整濃度至2×105 個/mL，將無菌蓋玻片放置在6孔細胞培養板中，每孔加入2 mL細胞培養懸液，于5% CO2培養箱中37 ℃培養，待細胞長至單層時，用PBS清洗3次，加入含有精油及其納米乳的RPMI-1640完全培養液（精油及其納米乳的濃度梯度為0、31.25、62.50、125.00、250.00 μg/mL），于5% CO2培養箱中37 ℃培養24 h，取出蓋玻片后于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態。

1.6.3 MTT法測定精油及其納米乳對HT-29細胞體外增殖的抑制。

采用0.25%胰酶-EDTA消化生長融合至70%～80%的HT-29細胞，調整濃度至1×104個/mL，每孔加入200 μL細胞培養懸液于96孔板中，5%CO2培養箱中37 ℃培養24 h后，棄去培養上清液，PBS清洗3次，加入含精油及其納米乳的RPMI-1640完全培養液（精油及其納米乳的濃度梯度為0、31.25、62.50、125.00、250.00 μg/mL），每種濃度設置6個復孔，并設置空白納米乳和空白對照組，37 ℃、5%CO2培養箱中孵育24 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，繼續培養4 h后，小心吸去上清液，每孔加入DMSO150 μL，室溫置于微量振蕩器上振蕩10 min，自動酶標儀（570 nm）下測量各孔的吸光度值，按下列公式計算細胞抑制率：

檸檬精油納米乳同時被作為對照進行了研究。由圖7可知，細胞在檸檬精油納米乳的最低濃度（31.25 μg/mL）下處理24 h后便體現出明顯的凋亡特征，其效果高于佛手精油納米乳。

2.3.2 MTT法測定佛手精油及其納米乳對HT-29細胞的生長抑制作用。

HT-29結腸癌細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶可將四唑鹽類物質（MTT）還原為紫色的結晶物，沉淀在細胞周圍，而死細胞無此功能，二甲基亞砜能溶解細胞中的結晶物，用酶標儀讀取吸光度值，從而檢測到細胞增殖狀態，這種方法快速、靈活，是一種比較常用的檢測細胞增殖的手段。

由圖8可知，不同濃度的佛手精油和佛手精油納米乳（31.25、62.50、125.00、250.00 μg/mL）作用于HT-29細胞后，細胞抑制率分別為10.8%、20.4%、41.2%、53.7%和10.7%、35.9%、71.3%、78.3%。空白對照組與空白納米乳組之間并無顯著性差異。這種現象說明將佛手精油制成納米乳之后，在相同的濃度下，佛手精油納米乳抑制細胞增殖的效果大大增強，但是這種增強效果并不是由納米乳基質造成的。通過和檸檬精油納米乳對比，佛手精油納米乳與檸檬精油納米乳對細胞的抑制率相似。

試驗中佛手精油納米乳對細胞的抑制作用遠遠大于佛手精油，可能是由于納米乳的顆粒小、比表面積大、吸附能力更強，可以很快地吸附在細胞表面。由于納米乳中表面活性劑的親水親油性，更有利于精油在水中的溶解。納米乳作為佛手精油的藥物載體，協助精油跨過細胞膜，使細胞內藥物濃度相對升高，明顯增強藥效。

3 結論與討論

近年來的研究發現，細胞凋亡受阻可能是腫瘤發病的重要機制，治療腫瘤的新思路趨向于誘導腫瘤細胞凋亡。該試驗研究了高壓均質法制備佛手精油納米乳的最佳工藝：油相質量分數10%（MCT ∶佛手精油為1 ∶4），乳化劑2.00%，用高速剪切機10 000 r/min剪切5 min，高壓均質機10 000 Psi，均質3次。并采用不同濃度的佛手精油及其納米乳作用于人結腸癌細胞HT-29，MTT法檢測不同藥物對HT-29細胞的生長抑制作用，結果表明62.50 μg/mL的佛手精油就可抑制HT-29細胞的增殖，同等濃度下，佛手精油納米乳的抑制效果遠高于精油原液。試驗測得3種納米乳的IC50分別為佛手精油201.039 μg/mL，檸檬精油納米乳98.159 μg/mL，佛手精油納米乳91.246 μg/mL。隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強，呈現明顯的劑量依賴型。說明佛手精油及其納米乳對人類結腸癌細胞有一定的抑制作用，但抑制機理還需要進一步的研究。

有研究表明，佛手精油中的主要成分是萜類物質檸檬烯和蒈烯。經前期試驗，佛手精油的主要成分為D-檸檬烯，檸檬精油的主要成分為（-）-檸檬烯，其相對含量分別占53.26%和79.27%。早在20世紀70年代，人們就發現檸檬烯具有抗腫瘤活性。檸檬烯抗癌機制主要有化學預防作用、抑制細胞周期與誘導細胞凋亡以及抑制腫瘤的侵襲與轉移等。近年來，人們對檸檬烯的抗癌活性進行了廣泛的研究，并發現其抗癌功效具有廣譜性[16]，對乳腺癌、肝癌、結腸癌等均具有抑制作用，并能減輕各種癌癥帶來的損傷[17]。麻艷芳等[18]研究結果表明，佛手揮發油具有抑制MDA-MB-435癌細胞增殖的作用，低、中濃度的佛手揮發油誘導細胞凋亡且將細胞周期阻滯在S期和G2/M期，而高濃度的佛手揮發油引起細胞壞死。呂學維等[19]研究結果表明佛手揮發油可有效殺傷體外培養的小鼠B16黑色素瘤細胞，低中劑量的佛手揮發油可誘導細胞凋亡，高劑量的佛手揮發油可致細胞壞死。

該研究證實了佛手精油及其納米乳對HT-29細胞的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強，呈現明顯的劑量依賴型。說明佛手精油及其納米乳對人類結腸癌細胞有一定的抑制作用，但抑制機理還需要進一步研究。

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