新優綠化植物冬紅離體培養與組培快繁技術研究

余平福 藍學 覃林海

摘要 [目的]建立冬紅組培再生體系。[方法]從外植體消毒、外植體出芽誘導、無菌芽繼代增殖、壯苗、生根、移栽等方面建立冬紅組培再生體系。[結果]用75%乙醇30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min進行外植體消毒效果最好；較好的外植體出芽誘導培養基為MS+ 6-BA 0.2 mg/L+ IBA 0.4 mg/L+蔗糖3.0%，誘導率為80%；繼代增殖培養基：改良MS +6-BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L+蔗糖4.0%的有效苗最多，增殖系數為3.8；壯苗培養基以改良MS +6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L +蔗糖3.0%的效果最好；生根培養基1/3MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖1.5%的生根率最高，達85%；移栽基質以泥炭土∶黃泥∶河沙（V∶V∶V=1∶1∶1）的混合基質較好，30 d后移栽成活率高達90%。[結論]該研究基本建立了冬紅組培快繁技術體系，為實現冬紅組培苗木批量化生產奠定了理論基礎。

關鍵詞 冬紅；組培快繁；增殖；壯苗；生根；移栽

中圖分類號 S723.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）18-0083-03

Technical System of Tissue Culture on Holmskioldia sanguinea Retz.

YU Pingfu， LAN Xue， QIN Linhai

（Guangxi Weidu State Forest Farm， Laibin， Guangxi 546100）

Abstract [Objective]To establish the tissue regeneration system of Holmskioldia sanguinea Retz. .[Method]A technique system of tissue culture of H. sanguinea Retz.was established from the aspect of explant disinfection，sterile bud proliferation，strong seedling， rooting and transplanting.[Result]The best sterilization method was 75% alcohol 30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min；explants induction media was MS+ 6BA 0.2 mg/L+ IBA 0.4 mg/L+ sucrose （3.0%）， induction rate was 80%；subculture multiplication media was modified MS +6BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L + sucrose （4.0%）， multiplication coefficients reached 3.8；growthpromoting culture media was modified MS+6BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L +sucrose （3.0%）；rooting culture media was 1/3MS+ NAA 0.5 mg/L +sucrose （1.5%）， and the rooting rate was up to 85%；the best transplantation media was peaty soil ， yellow soil and fine sand mixture matrix （V∶V∶V=1∶1∶1）， and transplanting survival rate could reach 90% after 30 days .[Conclusion]This study basically established the rapid propagation technology system of H. sanguinea Retz.， which laid a theoretical foundation for the realization of the batch production of seedlings of H. sanguinea Retz..

Key words Holmskioldia sanguinea Retz.；Tissue culture；Multiplication；Buds growthpromoting；Rooting；Transplantation

冬紅（ Holmskioldia sanguinea Retz.）原產于喜馬拉雅，為馬鞭草科冬紅屬植物，又名陽傘花、帽子花，花頂生，聚傘花序，花冠呈彎曲筒狀而微扁平，橙紅色，它的花在冬季依然能呈現出絢麗的紅色，極為鮮艷奪目，故而得名[1]。冬紅枝條伸長具蔓性，耐修剪，適用于花架、花廊、坡墻和圍籬綠化、盆栽等，可在我國的熱帶和南亞熱帶地區栽培[1]。由于冬紅是難得的冬季開花植物，景觀價值高且適應性強，且種植范圍廣，因此是城市綠化和鄉村美化的優良種質資源[2]，市場上對其苗木需求量大。通過組培快繁技術，可實現短周期、大批量地推廣冬紅優質種苗，滿足市場需求。在冬紅組培快繁方面，國內鮮有相關研究報道。筆者以冬紅帶腋芽莖段為外植體，研究冬紅組培關鍵技術，擬建立一套成熟的冬紅組培再生體系，填補相關方面的技術空白，為批量化生產冬紅組培苗木提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料（外植體）為冬紅長勢健壯、無病蟲害、半木質化的帶腋芽枝條。外植體采集應盡量選擇在連續晴天3 d以上的天氣，于中午進行。

1.2 外植體消毒及培養

摘去外植體葉片，剪成合適長度的帶芽莖段，進行消毒處理。在無菌條件下，使用75%乙醇、0.1%HgCl2、0.2% HgCl2和NaClO共4種滅菌劑，設置不同的滅菌劑濃度和滅菌時間組合（表1），將滅菌的外植體最后用無菌蒸餾水沖洗6遍，風干后接入MS基本培養基中。每個處理50瓶，每瓶接入1芽。10 d后觀察結果，統計污染率，進行對比分析，篩選出最佳外植體消毒方法。

1.3 誘導及繼代培養

培養基以MS培養基為基礎，根據無菌苗的生長狀況和培養需要進行適當改良，調節培養基pH至5.8，瓊脂6%，附加生長調節劑6-BA、KT、IBA、NAA等。

1.3.1

外植體出芽誘導培養。將消毒獲得的無菌外植體分別轉接到出芽誘導培養基上，出芽誘導培養基以MS為基本培養基，蔗糖3.0%，生長調節劑配比如下：C1，6-BA 0.1 mg/L+ IBA 0.2 mg/L；C2，6-BA 0.2 mg/L+ IBA 0.4 mg/L；C3，6-BA 0.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L。每個處理20個重復，每個重復1個外植體，20 d后統計誘導率。

1.3.2

增殖培養。將無菌芽單個切下，接種至增殖培養基中。增殖培養以改良的MS培養基為基本培養基，蔗糖4.0%，生長調節劑配比如下：C4，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；C5，6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C6，6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L；C7，6-BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L。每個處理20個重復，每個重復1個芽，20 d后統計增殖系數，增殖系數=增殖所得芽數/接入的外植體總數。

1.3.3

壯苗培養。壯苗培養基以改良的MS培養基為基本培養基，蔗糖3.0%，生長調節劑配比如下：C8，6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C9，6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L；C10，NAA 0.2 mg/L；C11，IBA 0.2 mg/L。將增殖培養獲得的不夠健壯的無菌叢芽單個切下，接種至壯苗培養基中，每個處理20個重復，每個重復1個芽，20 d后觀察苗的生長情況。

1.3.4

生根培養。選取健壯、高度為4～6 cm的無菌苗進行生根培養。培養基以1/3 MS為基本培養基，蔗糖1.5%，所含生長調節劑如下：C12，NAA 0.5 mg/L；C13，NAA 1.0 mg/L；C14，IBA 0.5 mg/L；C15，IBA 1.0 mg/L。每個處理20個重復，每個重復1個芽，20 d后統計生根率。

1.4 煉苗移栽

當生根苗在培養瓶內具3～4根長約2 cm的根系時，即可出瓶移栽，出瓶前煉苗3～5 d。移栽基質采用以下3個配比：C16，黃泥；C17，泥炭土∶黃泥（V∶V=1∶1）；C18，泥炭土∶黃泥∶河沙（V∶V∶V=1∶1∶1）。每個處理移20株苗，放置育苗棚內，進行同樣的水肥管理，分別于15、30 d后統計移栽成活率。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒效果

不同的消毒處理效果差異明顯。由表1可知，當使用75%乙醇和NaClO消毒時，污染率最高，效果達不到預期，消毒處理后，外植體上還有很多存活的霉菌和細菌。在設置的4種消毒處理中，污染率最低的為處理3，但是其存活率極低，外植體大部分褐變死亡。處理4（75%乙醇30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min）的效果最好，在獲得較低污染率的同時，保證了存活率，且所得無菌外植體依然保有活力。

2.2 不同生長調節劑濃度對外植體出芽誘導的影響

3種培養基上冬紅外植體的出芽誘導率見表2。C1和C2培養基都能成功誘導外植體長新芽且無愈傷，接種20 d后新芽長勢強壯，但C2培養基誘導率明顯高于C1培養基。相反，C3培養基可能由于生長調節劑濃度過高，外植體上產生大量愈傷組織，出芽誘導率最低，芽畸形，新葉卷曲玻璃化。可知，用C2培養基（MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.4 mg/L）對冬紅外植體進行出芽誘導培養效果最好。

2.3 不同生長調節劑濃度對繼代增殖的影響

由表3可知，生長調節劑濃度是影響無菌芽增殖的關鍵因素，無菌芽的增殖隨著細胞分裂素總濃度的升高而增多，當6-BA濃度為2.0 mg/L，NAA濃度為0.5 mg/L時，無菌芽的增殖系數最高，獲得的叢芽最多，但是有效苗較少，分生芽的生長受到抑制，生長較慢，長勢弱。綜合而言，效果最好的增殖配方是C7培養基（6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L），細胞分裂素6-BA、KT和生長素NAA配合使用，增殖芽苗生長健壯，畸形苗率低，增殖系數較高，平均增殖系數為3.8，是誘導增殖的理想生長調節劑配比，增殖效果如圖1所示。

2.4 不同生長調節劑濃度對壯苗培養的影響

對于部分增

殖獲得的不夠健壯的無菌芽叢進行復壯培養，結果見表4。合適濃度的生長素和低濃度細胞分裂素6-BA配合使用，能夠有效促進冬紅無菌苗復壯。從試驗結果可知，生長素NAA比IBA的促生效果更好，當0.2 mg/L NAA配合0.1 mg/L 6-BA使用時，無菌芽的復壯效果最好，生長快且健壯，增殖獲得的小芽葉片濃綠有光澤，可用于再次增殖培養或者直接用于生根。單獨使用生長素的效果不及生長素和細胞分裂素配合使用，當培養基中僅添加0.2 mg/L NAA時，無菌芽生長快，但是芽纖細且基部產生愈傷較多，不利于生根培養或繼代增殖；當培養基中僅添加0.2 mg/L IBA時，無菌芽有一定程度的復壯，但是生長較慢。

2.5 不同生根劑處理對無菌苗不定根發生的影響

4種不同濃度生根劑對冬紅無菌苗不定根發生的影響見表5。NAA處理的生根效果明顯好于IBA，其生根率高，根系粗壯旺盛，當NAA濃度為0.5 mg/L時，生根率最高，達85%。IBA處理的生根率都較低，根系均少且弱。不同批次的試驗結果表明，生根效果除了與生長調節劑有關系外，無菌苗本身的因素也有影響，不同繼代次數的無菌苗經同樣的生根劑處理后，生根率會有差異，這可能與組培苗的木質化程度、體內的生長調節劑積累等因素有關。針對不同繼代苗的生長特性，對生根劑處理和培養基進行適當的調整，生根率基本保持在80%以上。圖2為在C12培養基上，冬紅無菌苗根系發達粗壯。

2.6 煉苗移栽

當生根組培苗經過開瓶煉苗后，洗凈培養基，分別栽種到3種經過消毒的基質中，移栽試驗結果見表6。由表6可知，不同基質中的移栽成活率不同，其中全黃泥的成活率最低，30 d時的成活率為70%，泥炭土∶黃泥∶河沙以體積比為1∶1∶1的混合基質最適合冬紅組培苗的生長，30 d時已完全適應土壤基質和溫室環境，生長健壯，抽出新梢，成活率高達90%。

3 結論與討論

通過對冬紅離體培養進行系統研究，建立冬紅組培快繁技術體系如下：外植體消毒滅菌的最佳方法為75%乙醇30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min，外植體出芽誘導最佳培養基為MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.4 mg/L+蔗糖3.0%；繼代增殖培養基以改良MS +6-BA0 .5 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖4.0%的效果最好；最適壯苗培養基為改良MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖3.0%；生根培養基以1/3MS+ NAA 0.5 mg/L+蔗糖1.5%的效果最好；泥炭土∶黃泥∶河沙（V∶V∶V=1∶1∶1）混合基質是最適移栽基質。

培養材料的消毒是組織培養過程中的一個重要環節，是決定組織培養成敗的關鍵。該研究中外植體采用冬紅帶腋芽莖段，帶菌較多，對于這樣的外植體，使用75%乙醇和NaClO進行滅菌，效果達不到預期。HgCl2的消毒效果優于NaClO，一般采用0.1%～0.2%消毒效果最好，但是其消毒時間較難掌握，當濃度低、消毒時間短時，消毒效果不理想，若濃度高、消毒時間長，則外植體褐化死亡，采用分段消毒法（濃度和消毒時間）可緩解這一矛盾，獲得更好的滅菌效果[3-4]。

合理的生長調節劑配比是成功篩選獲得各階段成熟配方的關鍵。沈海龍[5]、胡繁榮[6]指出：要促進叢生芽的形成，就要提高細胞分裂素與生長素的比值，但濃度不宜過高；進行壯苗培養時，生長素的生物學效應高于細胞分裂素，筆者的研究結果也證實了該結論。該研究中，增殖培養時高濃度的6-BA（1.0～2.0 mg/L）或6-BA和KT（各0.5 mg/L）分別與較低濃度的NAA（0.2 mg/L）組合均能誘導芽增殖，且獲得較高的增殖系數，6-BA與KT配合使用效果更佳；在壯苗培養時，稍高濃度的NAA（0.2 mg/L）與低濃度的6-BA（0.1 mg/L）組合能夠使長勢較弱的叢生芽復壯。生長素類型及使用濃度對組培生根效果影響顯著[7-8]。就冬紅而言，在該研究中NAA的促生根效果明顯優于IBA，0.5 mg/L是其較合適的濃度。

該研究篩選獲得了冬紅離體培養的關鍵配方，在開展冬紅組織培養時，要根據培養材料的具體情況，比如木質化程度、苗內生長調節劑積累和繼代次數等，對培養基進行相應的優化調整。該研究基本建立了冬紅組培快繁技術體系，為實現冬紅組培苗木批量化生產奠定了理論基礎。

參考文獻

[1] 肖春芬，普華瓊.冬紅扦插技術[J].西南園藝，2005，33（1）：28.

[2] 裴鑒，陳守良，方文哲，等.中國植物志：第65卷第1分冊[M].北京：科學出版社，1982.

[3] 楊舒婷，林茂，王華新，等.崇左金花茶的外植體滅菌研究[J].北方園藝，2013（3）：124-126.

[4] 龔一富.植物組織培養實驗指導[M].北京：科學出版社，2011.

[5] 沈海龍.樹木組織培養微枝試管外生根育苗技術[M].北京：中國林業出版社，2009.

[6] 胡繁榮.植物組織培養[M].北京：中國農業出版社，2009.

[7] 葉飛，建德鋒.合果芋組培苗的生根與移栽技術研究[J].江蘇農業科學，2012，40（11）：196-197.

[8] 姚瑞玲，王胤，吳幼媚.馬尾松組培生根關鍵因子分析[J].廣西植物，2016，36（11）：1288-1294.