光葉山楂高效再生體系的建立

武玉婷 石嶺 張建中 賈建宇 云利俊

摘要 [目的]建立光葉山楂高效再生體系。[方法]以光葉山楂莖尖為外植體，通過植物生長調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)基配比，建立光葉山楂高效再生體系。[結(jié)果]光葉山楂初代培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基配方為1/4MS+ BA 0.1 mg/L；愈傷組織形成最適培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+CPPU 0.01 mg/L；繼代培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基配方為MS+BA1.0 mg/L和MS+BA1.5 mg/L+IAA0.1 mg/L；生根培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為1/4MS+IAA1.0 mg/L；100 mg/L BA浸蘸嫩莖基部30 min，外植體的生根效果最好。[結(jié)論]該研究可為光葉山楂的開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞 光葉山楂；再生體系；培養(yǎng)基；植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號 S661.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）18-0079-04

Establishment of Efficient Regeneration System of Crataegus dahurica Koehne

WU Yuting1，SHI Ling1，ZHANG Jianzhong2 et al

（1.College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010019；2.Hohhot Science and Technology Bureau，Hohhot，Inner Mongolia 010000）

Abstract [Objective]To establish the efficient regeneration system of Crataegus dahurica Koehne.[Method]This test used stem tip of C. dahurica Koehne as explant to establish the efficient regeneration system of C. dahurica Koehne through plant growth regulator and medium ratio.[Result]The optimal primary medium was 1/4MS + BA0.1 mg/L， the suitable medium for callus was 1/2MS + NAA0.1 mg/L + CPPU 0.01 mg/L，the optimal subculture medium was MS + BA1.0 mg/L and MS + BA1.5 mg/L + IAA0.1 mg/L， the suitable rooting medium was 1/4MS + IAA1.0 mg/L，the explants got the best rooting effect at 100 mg/L BA dipped in the base of young stem 30 min.[Conclusion]This study can provide reference for the development and utilization of C. dahurica Koehne.

Key words Crataegus dahurica Koehne；Regeneration system； Medium； Plant growth regulator

山楂屬（Crataegus L.）植物屬于薔薇科（Rosaceae）植物，廣泛分布于亞洲、歐洲、中北美洲及南美洲的北部，主要集中于北美洲，世界上共有該屬植物1 000余種[1]。山楂在我國栽培利用有悠久的歷史，《中國植物志》記載了我國山植屬植物有17種2個變種[2]。光葉山楂（C.dahurica Koehne）是山楂屬植物的一個種，主要分布于黑龍江、內(nèi)蒙古以及西伯利亞和蒙古北部等地區(qū)。光葉山楂屬落葉喬木或灌木，花色純白，果實顏色較淺，果近球形或長圓形，具24小核，葉片大部分呈菱狀卵形，通常兩面無毛[3]；耐庇蔭、耐寒、耐旱能力強，適應(yīng)性廣，常散生于河岸、山麓的興安落葉松白樺混交林中[4]。

光葉山楂具有營養(yǎng)、保健、藥理、生態(tài)等多方面的利用價值，對光葉山楂進行全面研究和開發(fā)利用尤為重要。雖然各國研究人員對山楂屬植物進行了較為廣泛的研究，但在深度上遠不如其他薔薇科果樹[5]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)對光葉山楂進行離體快繁，可在短期內(nèi)生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)原材料，緩解山楂種子萌發(fā)難、苗木繁殖慢的問題，為其深入研究提供材料；利用組織培養(yǎng)技術(shù)對光葉山楂進行抗性育種，可從根本上利用光葉山楂的優(yōu)點進行品種改良，提高光葉山楂果實和苗木的利用率，對光葉山楂的開發(fā)利用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

光葉山楂莖尖以及經(jīng)組織培養(yǎng)獲得的光葉山楂莖段。

1.2 方法

1.2.1 初代培養(yǎng)。

1.2.1.1

BA濃度及MS培養(yǎng)基對光葉山楂的影響。采用不同濃度BA（0.1、1.0 mg/L）及不同類型培養(yǎng)基（MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS、1/16MS）組合共10個處理對光葉山楂進行培養(yǎng)，記為A1～A10，每瓶接種4個，每處理5瓶，重復3次，培養(yǎng)周期為90 d。

1.2.1.2

NAA及CPPU濃度對光葉山楂的影響。以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度NAA（0、0.01、0.10 mg/L）與不同濃度CPPU（0.01、0.10 mg/L）組合共6個處理，記為A11～A16，每瓶接種4個，每處理5瓶，重復3次，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2.2 繼代培養(yǎng)。

1.2.2.1 BA濃度及MS培養(yǎng)基對光葉山楂的影響。剪取無菌苗帶節(jié)莖段，接種于MS和1/2MS培養(yǎng)基上，分別添加不同濃度BA（0.1、0.5、1.0 mg/L），共6個處理，記為B1～B6，每瓶接種4個，每處理5瓶，重復3次，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2.2.2 IAA及BA濃度對光葉山楂的影響。剪取無菌苗帶節(jié)莖段，接種于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，添加不同濃度IAA（0.1、0.5 mg/L）和BA（1.0、1.5、2.0 mg/L），共6個處理，記為B7～B12，每瓶接種4個，每處理5瓶，重復3次，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2.3 生根培養(yǎng)。

1.2.3.1

生長素種類、濃度及培養(yǎng)基對光葉山楂的影響。選取繼代培養(yǎng)后生長一致的光葉山楂無根苗，接種于含有不同濃度IAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）以及IBA（0.5、1.0、1.5 mg/L）的2種培養(yǎng)基（1/2MS、1/4MS）上，共12種處理，記為C1～C12，每瓶接種4個外植體，每處理5瓶，重復3次，培養(yǎng)周期為90 d。

1.2.3.2

BA浸蘸時間對光葉山楂的影響。用100 mg/L BA浸蘸光葉山楂嫩莖基部，浸蘸時間分別為30、60 min，記為C13～C14，浸蘸后接種于不含任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)周期為90 d。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

各試驗培養(yǎng)基均含有蔗糖3%、瓊脂0.7%，用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)pH至5.8～60，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后凝固備用；外植體接種后，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照強度為1 500～3 000 lx，光照時數(shù)均為16 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)

2.1.1 BA濃度及MS培養(yǎng)基對光葉山楂初代培養(yǎng)的影響。

由表1可知，在A2～A5處理下，光葉山楂莖尖生存率和平均株高均高于A7～A10處理，其中A4處理對光葉山楂莖尖生存率效果最佳為91.6%，A3處理嫩莖的平均高度最高達24.3 mm，在A1、A6和A10處理下，光葉山楂外植體均無嫩莖形成，A3～A5處理光葉山楂嫩莖形成率均高于A8～A10處理，其中A3處理是最利于嫩莖形成的處理組合，在A4和A8處理下，培養(yǎng)所得嫩莖增殖倍數(shù)相同且最高達2.0。

2.1.2 NAA及CPPU濃度對光葉山楂初代培養(yǎng)的影響。

由表2可知，A13、A15和A16處理下，光葉山楂莖尖生存率均達100%，A11和A14處理下，外植體無愈傷組織形成，A12和A13處理愈傷組織形成率均高于A15和A16處理，其中A13處理愈傷組織形成率達100%，A13和A16處理下，愈傷組織大小一致，均為6.2 mm。

2.2 繼代培養(yǎng)

2.2.1 BA濃度及MS培養(yǎng)基對光葉山楂繼代培養(yǎng)的影響。

由表3可知，6種處理下光葉山楂的生存率以及嫩莖形成率都很高，其中B1～B3以及B6處理下，生存率均為100%，除B3處理外，其他處理嫩莖形成率均為100%，B4處理下光葉山楂平均株高最大為30.1 mm，B2和B5處理下增殖倍數(shù)相同，B6處理下增殖倍數(shù)最大為3.6。

2.2.2 IAA及BA濃度對光葉山楂繼代培養(yǎng)的影響。

由表4可知，6種處理均誘導形成嫩莖，其中B11處理下嫩莖形成率最高為83.6%，平均株高為13.4～18.1 mm，B8處理平均株高為18.1 mm，B8處理下光葉山楂嫩莖增殖倍數(shù)最大為2.4。

2.3 生根培養(yǎng)

2.3.1 培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑對光葉山楂生根的影響。

由表5可知，IAA和IBA的濃度過高或過低均不利于光葉山楂無菌苗生根；在同一培養(yǎng)基下，同種濃度的IAA比IBA更利于無菌苗生根培養(yǎng)；當生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度相同時，1/4MS培養(yǎng)基較1/2MS培養(yǎng)基更利于外植體生根。綜合分析表明，C8處理是最利于光葉山楂生根的培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑組合，外植體生根數(shù)11條、生根率55%、平均根長36.4 mm。

2.3.2 BA浸蘸嫩莖對光葉山楂生根的影響。

由表6可知，浸蘸BA均可誘導外植體生根，C13處理下，外植體生根數(shù)9條、生根率45%、平均根長50.1 mm，C14處理下外植體生根數(shù)僅1條、生根率僅有5%、平均根長12.2 mm，因此誘導生根較好的處理時間是30 min。

3 結(jié)論與討論

3.1 初代培養(yǎng)

通過對光葉山楂初代培養(yǎng)進行研究，結(jié)果表明，在同一BA濃度下，光葉山楂外植體的生存率、嫩莖形成率、嫩莖增殖倍數(shù)及平均株高均隨著MS培養(yǎng)基中大量元素含量的降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，說明MS培養(yǎng)基中大量元素過高或過低均不利于光葉山楂的初代培養(yǎng)，在1/4MS培養(yǎng)基下，外植體初代培養(yǎng)的效果最好，因此，最利于光葉山楂莖尖初代培養(yǎng)的配方為1/4MS+BA 0.1 mg/L。

愈傷組織誘導是通過細胞內(nèi)特定基因的激活和表達，形成特定的蛋白來調(diào)控的，其中起重要作用的是激素種類及配比[6]。該試驗中，當CPPU濃度一定，NAA濃度為0時，外植體可以存活，但無愈傷組織形成；隨著NAA濃度的增加，光葉山楂外植體生存率、愈傷組織形成率、愈傷組織大小均增大，說明在一定的濃度范圍內(nèi)，NAA可促進光葉山楂外植體的愈傷組織形成；當NAA濃度一定時，高濃度CPPU可促進愈傷組織生長，但愈傷組織形成率較小，說明CPPU抑制愈傷組織的形成但不抑制其生長，同時也證明了CPPU是一種非常有效的細胞分裂素[7]。因此，適宜光葉山楂愈傷組織形成的最適培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+CPPU 0.01 mg/L。

3.2 繼代培養(yǎng)

通過研究不同濃度BA及培養(yǎng)基類型對光葉山楂外植體繼代培養(yǎng)影響，結(jié)果表明，在1/2MS培養(yǎng)基中，外植體增殖倍數(shù)隨BA濃度增大呈先增大后降低的趨勢，說明BA濃度過大或過小都抑制外植體的增殖生長，在MS培養(yǎng)基中，增殖倍數(shù)隨BA濃度增大而增大，當BA濃度一定時，MS培養(yǎng)基中外植體增殖倍數(shù)大于1/2MS培養(yǎng)基，由此可見，培養(yǎng)基中大量元素濃度越高越能促進外植體的增殖生長。當IAA濃度為0.1 mg/L時，外植體增殖倍數(shù)隨BA濃度的增大呈先增大后降低的趨勢，當IAA濃度為1.0 mg/L時，外植體增殖倍數(shù)隨BA濃度的增大逐漸降低，可見外植體增殖倍數(shù)受BA與IAA共同調(diào)控。綜合考慮，適宜光葉山楂繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為MS+BA1.0 mg/L和MS+BA 1.5 mg/L+IAA0.1 mg/L。

3.3 生根培養(yǎng)

對于實際生產(chǎn)來說，植物具有發(fā)達的根系才能吸收土壤中的水分和養(yǎng)分，因此組織培養(yǎng)中無菌苗的生根是組織培養(yǎng)快繁的關(guān)鍵[8]。該研究結(jié)果表明，1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基中外植體生根率隨IAA濃度的增大表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，IAA濃度過高或過低均不利于外植體生根；同一濃度下IAA比IBA更利于生根；添加同種濃度的IAA下，1/4MS培養(yǎng)基外植體生根率高于1/2MS培養(yǎng)基，證明低濃度無機鹽培養(yǎng)基更利于外植體生根，生根培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為1/4MS+IAA1.0 mg/L。

用100 mg/L的BA浸蘸光葉山楂嫩莖基部后接種于不含植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的1/2MS培養(yǎng)基中，探索兩步生根法對外植體生根率的影響，結(jié)果表明，BA浸蘸30 min外植體生根效果較好，BA浸蘸60 min抑制外植體的生根。

參考文獻

[1] 侯寬昭.中國種子植物科屬辭典[M].北京：科學出版社，1958：115.

[2] 中國科學院北京植物研究所.中國植物志：第36卷[M].北京：科學出版社，1974：189.

[3] 賈敬賢，賈定賢，任慶棉.中國作物及其野生近緣植物·果樹卷[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[4] 印萬芬.東北地區(qū)山楂屬植物的種類分布和用途[J].特產(chǎn)科學實驗，1983（1）：23-25，22.

[5] 李浚明.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2004.

[6] 李浚明.植物組織培養(yǎng)教程[Z].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2004.

[7] BRUCE M I，ZWAR J A.Cytokinin activity of some substituted urea and thioureas[J].Proc Roy Soc B，1966，165：245-265.

[8] 龔一富.植物組織培養(yǎng)實驗指導[M].北京：科學出版社，2011.