營養因素影響蜜蜂級型分化的研究進展

鄭素梅 羅娟 高玉人 萬萍

摘要從營養元素方面綜述蜜蜂級型分化的研究進展，介紹蜂王漿中10-HDA、Royalactin，蜂糧中相關MicroRNA對蜜蜂級型分化的影響，并展望今后蜜蜂級型分化分子機制的研究方向。

關鍵詞蜜蜂；級型分化；MicroRNA

中圖分類號S89文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）05-0025-03

AbstractThe research progress of caste differentiation of honey bee was reviewed from the aspects of nutritional factors，the effects of 10HDA and Royalactin in royal jelly and related MicroRNA in bee bread on caste differentiation of honey bee were introduced. The research direction of caste differentiation mechanism of honey bee was also prospected.

Key wordsHoney bee；Caste differentiation；MicroRNA

典型的蜂群是由蜂王、工蜂和雄蜂2種性別3種類型的蜜蜂群體組成，其中雌性蜜蜂分化出蜂王和工蜂2種級型[1]。蜂王的個體比較大，性器官發育完全，專門負責產卵生殖，繁衍后代；工蜂個體比較小，是生殖器發育不完全的雌蜂，專門負責建筑巢室、采集食料、哺育幼蟲、清理巢室以及調節巢濕等[2-3]。蜜蜂是一種經濟昆蟲，同時作為社會生物學研究的模式生物，是一種高度真社會性昆蟲，生殖勞動分工在社會性昆蟲當中存在著極重要的進化意義，而其基礎是級型分化。

級型分化是指在社會性昆蟲群體中，相同性別的個體在形態結構、生理狀態和行為方式上存在顯著差異的現象。級型分化對于蜜蜂生物學的研究有著舉足輕重的意義，具體是指雌性蜜蜂幼蟲分化成生殖個體和非生殖個體——既可發育成為可育的蜂王個體，也可發育成為不可育的工蜂個體的現象。蜜蜂級型分化的關鍵時期是3～5日齡，1～3日齡所有的幼蟲喂養蜂王漿，大于4日齡雌性幼蟲喂養由花粉和蜂蜜調制的蜂糧，發育成為工蜂，只有蜂王房里的幼蟲始終喂養蜂王漿發育完全成為蜂王[4]。蜂王和工蜂兩者都是由受精卵發育而來的雌性蜜蜂，具有相同遺傳物質的蜜蜂幼蟲在表型上存在巨大差異的關鍵環境決定因素在于差異性飼喂[5]。喂養蜂王漿的幼蟲發育成蜂王，喂養蜂糧的幼蟲發育成工蜂。

雌性蜜蜂級型分化現象是最典型的表觀遺傳現象之一。近年來，關于蜜蜂級型分化的研究已經取得了諸多重要進展[6-7]。長期以來，就營養對蜜蜂級型分化的研究主要集中在蜂王漿這一塊，但近期也有關于蜂糧對蜜蜂級型分化的影響研究。筆者綜合前人研究，主要從蜂王漿和蜂糧這兩個營養因素方面，綜述營養差異對雌性蜜蜂幼蟲級型分化產生的影響（圖1）。

1蜂王漿中相關物質的促進作用

蜂王漿的成分相對比較復雜，包括水、蛋白質、脂肪酸、游離氨基酸、糖類、維生素和礦物質等，它是蜜蜂巢中培育幼蟲的青年工蜂咽下腺和上顎腺分泌的乳漿狀物質，其中蛋白質和糖類是蜂王漿的主要成分[8-9]，普遍認為是蜂王漿刺激蜜蜂幼蟲分化成蜂王。

1.110-HDA是蜜蜂級型分化的主要活性因子

2011年，Spannhoff等[10]在《EMBO》雜志在線發表一項研究成果，研究表明蜜蜂幼蟲發育成為蜂王這一表觀遺傳現象可部分歸因于蜂王漿比蜂糧含有更高的組蛋白脫乙酰酶抑制劑（HDACi）活性。10-羥基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decanoic acid，10-HDA，王漿酸）是蜂王漿的主要成分之一，具有組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）活性。10-HDA 能夠抑制組蛋白去乙酰化酶（HDACs）的活性，從而使組蛋白乙酰化水平增加。組蛋白尾部氨基酸殘基的乙酰化能松弛染色質結構，增加轉錄因子對靶基因的可訪問性[11]。因此，組蛋白乙酰化水平的增加通常與基因表達的激活相聯系。HDACi能夠誘導細胞周期素依賴的蛋白激酶抑制因子p21，p21蛋白的主要功能是阻滯細胞的生長[12-14]。在蜜蜂幼蟲的發育過程中，10-HDA可能通過增加p21基因的表達量，抑制細胞生長，從而影響蜜蜂的生長發育。

此外，DNA甲基化水平與蜜蜂級型分化息息相關，相關研究表明，DNMT3（DNA甲基轉移酶）表達沉默，能夠使蜜蜂幼蟲的發育方向從工蜂轉向蜂王[15-16]。應用熒光定量 RT-PCR 技術分析發現3日齡幼蟲DNMT3基因表達水平與組蛋白去乙酰化酶4基因（HDAC4）的表達譜極為相似，都會隨著10-HDA 濃度的增加先顯著降低后又顯著升高，組蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）的活性對DNMT3基因的表達有重要的影響，繼而調控蜜蜂幼蟲的級型分化。

1.2Royalactin是蜜蜂級型分化的重要調控因子

蜂王漿的研究是蜂學領域的一個熱點，人們發現蜂王漿諸多生物學功能都是由主要王漿蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）產生的。MRJPs是一個比較大的蛋白家族，迄今為止已經有9個家族成員被發現，分別命名為MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4、MRJP5s、MRJP6、MRJP7、MRJP8和MRJP9，含量最高的MRJP1（57 kDa蛋白）占水溶性蛋白的48%[17]。目前，有報道證明，蜂王漿中的Royalactin蛋白（也稱為MRJP1）是西方蜜蜂級型分化的關鍵因子，而蜂糧中Royalactin蛋白含量相對較低。

Kamakura[18]在新鮮的蜂王漿中發現了一種被稱為Royalactin（MRJP1）的蛋白質，這種蛋白質能夠促進生長激素的分泌，進而調控一系列基因的表達，使幼蟲出現體型變大、卵巢發達等蜂王的特征，但是它不穩定，在保存過程中會降解。Kamakura進行了試驗比對，分別喂養蜜蜂幼蟲新鮮的蜂王漿以及存放30 d的蜂王漿，研究發現只有喂養新鮮蜂王漿的蜜蜂幼蟲最后分化成為蜂王。然而，在貯存30 d的蜂王漿中加入Royalactin后，發現其能夠誘導蜜蜂幼蟲分化成為蜂王。進一步研究發現，Royalactin可以通過脂肪體中的表皮生長因子受體（Egfr）激活P70 S6激酶，這種激酶對幼蟲體型變大有重要作用，能夠增加細胞分裂素活化蛋白激酶的活性，提高卵巢管發育必需的保幼激素水平，促進蜜蜂幼蟲卵巢的發育，該激素在幼蟲發育期間的第五日齡決定幼蟲向著蜂王方向發育。Royalactin通過脂肪體中的Egfr信號通路激活MAPK，引起蛻皮激素水平的上升，從而縮短蜜蜂幼蟲發育的時間，保幼激素和蛻皮激素兩者共同協作并調控蜜蜂幼蟲的級型分化。

2蜂糧中相關MicoRNA的調控作用

MicroRNA（miRNA）的長度為20～24個核苷酸，是一類內生的非編碼單鏈RNA分子，在動植物中參與轉錄后基因表達調控，能通過抑制mRNA翻譯或者降解mRNA在轉錄后水平對基因表達產生負調控作用；在特定情況下，還有可能進行翻譯激活從而正向調控基因的表達[19]。miRNA是表觀遺傳學主要研究方向之一。從理論上來說，蜜蜂作為一種高度社會化的昆蟲，其復雜的社會行為隨著基因表達的改變而受到調控，miRNA很有可能參與其中。

蜂糧是以花粉為原料，添加蜜蜂的分泌物并經蜜蜂調制加工，經微生物發酵而成。蜂王漿是青年工蜂食用花粉之后分泌的乳白色或者淡黃色的乳狀物，是其咽頭腺的分泌物，其中蛋白質和糖類是蜂王漿的主要成分。研究蜂王漿、蜂糧、花粉以及蜂蜜中的成分，發現蜂王漿里99.9%的miRNA都是動物源的。在蜂糧和花粉中發現了大量植物源的miRNA。Behura等[20]用熒光定量PCR的方法對20個miRNA在幼齡哺育蜂和老齡采集蜂大腦中的表達差異進行了比較。發現其中miRNA-124、miRNA-14、miRNA-276、miRNA-13b、let-7和miRNA-13a在幼齡哺育蜂的大腦中高度表達；miRNA-12、miRNA-9、miRNA-219、miRNA-210、miRNA-263、miRNA-92和miRNA-283在老齡采集蜂的大腦中高度表達。該研究說明，蜜蜂基于日齡發生行為的改變中可能有miRNA的參與。有相關研究發現食物中的miRNA能夠被吸收，而且吸收以后能夠被送到相關的組織和器官中去，跨界調控動物的基因，產生生物學作用[21-24]。

2.1相關植物miRNA對蜜蜂級型分化的影響

蜂糧和蜂王漿有一個最大的區別，即前者存在大量的植物miRNA。研究發現在蜂糧和花粉中可以利用qRT-PCR檢測到16種有代表性的植物miRNA（mir156a、mir157a、mir158a、mir160a、mir162a、mir166a、mir166g、Sly-miR167a、mir168a、mir172a、miR172c、mir390a、mir397a、mir403、miR824和mir845a），但在蜂王漿和蜂蜜中無法檢測到。

雌性蜜蜂幼蟲終身食用蜂王漿變成蜂王。然而，Zhu等[25]在蜂王漿中添加天然含量的人工合成的16種有代表性的植物miRNA，與對照組相比，發現添加植物miRNA組別中的蜜蜂幼蟲的表型更加傾向于工蜂，發育緩慢，體型變小、不育。將食物中的植物miRNA剔除之后再喂養，發現幼蟲趨向蜂王生長。該研究說明蜂糧中存在的植物miRNA或許通過抑制蜜蜂幼蟲發育以及級型分化的信號通路，繼而抑制了蜜蜂幼蟲的卵巢、體重以及整體發育，從而分化成為工蜂。這一結果在果蠅身上也得到了驗證。

2.2相關植物miRNA在蜜蜂級型分化信號通路中的調控作用

參與蜜蜂級型分化的信號通路有胰島素信號通路（IIS）、MAPK和S6K信號通路、蛋白激酶TOR信號通路等。TOR是真核生物中高度保守的一種大分子的Ser/Thr激酶，是免疫抑制劑雷帕霉素在體內的靶物質，能對營養以及生長因子等因素的變化做出應答反應，在細胞生長增殖過程中發揮中樞作用[26]。已有研究證明蜜蜂TOR（Apis mellifera TOR，amTOR）在幼蟲級型分化中具有促進作用：amTOR活性升高與蜜蜂幼蟲發育成蜂王息息相關，而降低amTOR活性將決定著蜜蜂幼蟲朝著工蜂的方向發展[27-28]。

2017年Zhu等[25]通過RNAhybrid和miRanda算法預測共有96個蜜蜂基因作為16種有代表性植物miRNA的靶基因。預測的96個基因中，大多數都只是一種植物miRNA的靶基因，而少數基因是2～3個miRNAs的共同靶基因。熒光素酶報告基因測定試驗表明miR162a特異性作用于amTOR并介導該基因的轉錄后抑制。

為了確定miR162a能單獨影響amTOR的表達，利用合成的miR162a或對照RNA喂養蜜蜂幼蟲。與喂養對照RNA的蜜蜂幼蟲相比，喂養miR162a食料的蜜蜂miR162a攝入量顯著增加以及amTOR mRNA水平降低。同樣，在喂養花粉總RNA或miRNAs（含16種代表性miRNA）的蜜蜂中，amTOR mRNA水平被下調。與對任何測試形態特征無影響的對照RNA不同，在食物中加入miR162a的蜜蜂幼蟲羽化后體重顯著減輕，體型以及卵巢變小，更加趨近于工蜂的表型[25]。

3小結

蜜蜂是一種經濟昆蟲，全球蜂群產生蜂產品的經濟效應不可估量，蜜蜂授粉所引發的經濟效應以及生態效應更是一個龐大的數字。蜜蜂幼蟲級型分化一向是蜜蜂生物學的

研究熱點，對于雌性蜜蜂級型分化的研究，不僅可以有效地豐富蜜蜂的生物學理論，而且對于加快蜂群的繁殖，迅速培育強群打下非常堅實的基礎，為廣大養蜂群體以及養蜂業貢獻有效的力量。蜂王和工蜂都是由受精卵發育而來的，兩者具有相同的遺傳物質，

但是在形態結構、行為和生理特征上存在明顯的差異，諸多研究表明這種差異主要是幼蟲時期的營養組分所造成的。研究蜜蜂幼蟲的主要食物來源——蜂王漿和蜂糧中各種活性組分的生物學功能對于解開工蜂和蜂王級型分化的謎團是一個非常關鍵的因素。但是，到目前為止，對于蜜蜂幼蟲食物中對級型分化起作用的相關組分的識別尚未終結，依然存在著未知領域，仍然需要進行深入研究。因此，蜜蜂對于表觀遺傳學的研究具有非常高的模型價值。對于影響蜜蜂級型分化的主要活性物質，研究人員做了大量工作，目前已發現蜂王漿中存在大量的10-HAD和Royalactin蛋白，其在蜜蜂級型分化中起關鍵作用[29]。近來的研究發現蜂糧中植物源的miRNA含量同樣也對工蜂的分化起著非常重要的作用。隨著新生物技術的發展以及新領域的開拓，影響蜜蜂幼蟲級型分化的活性物質和相關調控機制的研究逐漸豐富，可為哺乳動物表觀遺傳學的研究提供更多理論基礎。

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