大蒜鱗芽組培再生體系建立方法研究

吐爾遜娜依·迪力夏提 劉旭新 石強

[摘要]以山東和新疆白皮大蒜栽培品種為材料，建立了大蒜鱗芽為外植體的愈傷組織誘導再生體系。采用MS培養基，通過激素配比篩選試驗，比較快速誘導愈傷組織激素配比與方案，為供試大蒜品種脫病毒苗的快速繁殖奠定了基礎。篩選得到愈傷組織快速誘導與生長培養基與激素配比，結果表明：快速誘導愈傷組織最佳激素組合為：NAA 0.5mg/L+2，4-D 1.25mg/L+MS，愈傷組織繼代生長與幼苗分化激素組合為：6BA 5mg/L+NAA0.3mg/L，環境溫度25℃，光照16小時，8小時黑暗條件；所有這些結果為大蒜脫毒再生苗提純復壯與轉基因研究體系的建立都很有幫助。

[關鍵詞]大蒜；組織培養；再生體系

[中圖分類號]S633.4 [文獻標識碼]A

大蒜（Allium sativum L.）為百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，是因其具有獨特的風味和良好的藥用價值而全球性食用并種植的蔬菜。我國栽培歷史已達兩千多年，是世界最大的大蒜種植國，全國各地都有栽培。栽培大蒜由于花器官敗育，不能通過有性生殖形成種子，所以在生產中都是通過無性繁殖進行生產。大蒜在栽培過程中，常年無性繁殖過程使其出現容易染病毒、品種退化等問題，最終導致質量及產量下降，大家通常利用組織培養技術來進行大蒜組織脫毒，脫毒的分生組織再分化成無毒幼苗，這已經成為提升大蒜品質的一個手段。目前脫毒組織培養技術，已建立了以莖尖、根尖，真葉、貯藏葉、莖盤切塊、花序軸頂端分生組織，花藥和花原始體等為外植體的多種大蒜組織培養再生體系。各種外植體與其分化再生效果都有差異，本實驗利用大蒜鱗芽作為外植體選用不同植物激素之間優化配比，對大蒜愈傷組織誘導進行試驗，研究對比提出了一種高效的大蒜組織培養體系，為進一步對大蒜進行深入研究，如大蒜脫毒愈傷組織快速誘導到再生植株的成功分化，以及建立大蒜轉基因轉化體系，做一些基礎工作，得到了比較好的再生體系模式。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料是山東白皮大蒜（產地山東）和新疆白皮大蒜（吉木薩爾縣），從新疆昌吉市市場購買的當年新蒜。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配制及培養條件。基本培養基為MS固體培養基（M&S M519，Phytotechnology公司產品）含蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH值5.8，在培養箱中光照培養，培養溫度（25±1）℃，光強4000～5000lux培養于光照24h/d。植物激素采用2，4-D，6BA，2IP，NAA等（SIGMA公司產品）。

1.2.2 外植體準備。取無病無霉變的大蒜瓣放入清水中浸泡l0min，然后用無菌水沖凈，在超凈臺上將大蒜瓣橫切成2段，將有鱗芽的一段放入培養皿，切開剝出鱗芽，切2～3塊，10%的次氯酸鈉溶液中浸泡2min，后用無菌水沖洗3～5次。

1.2.3 愈傷組織誘導培養。將外植體接種在添加不同濃度配比激素組合（共42個處理）的MS培養基上，每瓶接種10個外植體，每個處理4～5瓶，接種15d后開始觀察及統計直徑超過3mm的愈傷組織。40d后繼代培養一次，使用相同的培養基，繼代培養1～2次。

1.2.4 數據記錄與處理。 經不同配比的激素組合處理的大蒜鱗芽愈傷組織，不定芽和生根情況各在培養40d和20d后開始進行記錄。通過目測法觀測不同激素配比對大蒜鱗芽組織培養的影響，觀察記錄愈傷組織發生率來計算愈傷組織誘導率，統計方法如下式所示：

2 結果與分析

2.1 不同激素配比處理對大蒜鱗芽愈傷組織誘導的影響

以MS固體培養基為基本培養基進行生長素與細胞分裂素的不同配比組合（共42個處理，激素配比與組合見表1），研究不同組合對大蒜鱗芽愈傷組織誘導率影響的試驗。大蒜愈傷組織在誘導培養20d左右開始出現，可以從外植體的一端或兩端或者整個外植體上產生，25d左右達到計數水平。經觀察計數得到各處理對大蒜鱗芽愈傷組織誘導率影響結果如表l。

當2，4-D濃度為1mg/L時，大蒜鱗芽誘導率隨NAA濃度的增加而降低；當NAA濃度為0.5mg/L時，誘導率隨2，4-D濃度的增加而增加，但2，4-D濃度超過1.25mg/L開始誘導率反而不再上漲。當2iP濃度為0.1mg/L時2，4-D濃度為1.5mg/L時的山東大蒜鱗芽愈傷組織和2，4-D濃度為2mg/L時的新疆大蒜鱗芽愈傷組織誘導率效果最好。

2.2 不同處理愈傷組織幼芽分化誘導的影響

大蒜愈傷組織成功誘導出來后，選定不同濃度配比的激素（6BA）繼續進行培養，能成功誘導分化出幼芽（圖1），但是大蒜愈傷組織誘導成芽需要更長時間（表2）。

3 結論

本研究綜合考慮大蒜鱗芽組織愈傷組織形成率和周期等關鍵因素，從控制誘導與分化的角度篩選最佳植物激素組合的培養基，有利于大蒜鱗芽組培再生技術的推廣應用。單子葉植物轉化體系往往采用農桿菌攜帶目的基因轉化愈傷組織，通過抗性篩選得到轉化植株，所以此實驗不僅對大蒜深入進行生物工程研究打下基礎，而且對大蒜轉基因體系的建立都具有重要應用價值。

4 展望

隨著生物技術手段的不斷豐富，組織培養技術作為重要的技術手段，為人類科學的進步和發展提供了強大的支撐，而大蒜的組織培養和快繁技術的完善使蒜苔和鱗莖產量有所增加，高產量及質量的目的達到了。然而脫毒植株在實際應用中可能再度感染，加之試管繁殖系數尚低，因而規模化生產技術還需進一步研究。而將現代生物技術納入大蒜植物的遺傳改良和育種程序，將會加速培育出高品質、高抗逆性、更有應用價值的新品種，以滿足人們生活水平不斷提高的需求。

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