不同自制植物環保酵素在不同發酵時間抗氧化力的對比研究

徐德金 陳智松 康天旭 劉佩勇

摘 要 為了對比不同原料的環保酵素抗氧化力的差異，自制了維生素C和番茄紅素含量較高的8種環保酵素，分別測定不同濃度不同發酵時間環保酵素對羥基自由基、超氧自由基和DPPH自由基的清除能力。結果表明，8種酵素對各自由基的去除能力差別不大，其中維生素C含量較高的果蔬環保酵素對3種自由基的清除作用較好，酸棗酵素對羥基自由基、DPPH自由基的清除能力最好，掐不齊酵素對超氧自由基的清除能力最好。隨著環保酵素稀釋倍數的增加，酵素對自由基的清除能力逐漸下降。羥基自由基、超氧自由基和DPPH 自由基的最大去除率分別可達 98.52%、96.98%和99.77%。為達到最大去除率，最佳酵素濃度均為原濃度，最佳發酵時間分別為9個月、3個月和9個月，但時間對清除能力的影響不明顯。

關鍵詞 環保酵素；發酵時間；抗氧化

中圖分類號：TQ925 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.11.073

研究表明，酵素具有清除自由基的能力，蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶是其主要的功效酶[1]，因此目前酵素主要用于農業改善土質[2]、減少蟲害、增加土壤肥力和醫藥治療皮膚病、抗炎、抗菌、抗癥等方面[3-10]。近年來，環保酵素在環境污染治理方面的研究開始受到關注，但相關研究報道幾乎空白。本實驗以家庭中最常見的果蔬作為選材，研究結果可為日常生活中環保酵素的使用提供理論依據，利用這些果蔬制作的酵素或將取代市面上一些化學防腐劑，降低水果腐爛速度，使人體更加健康，同時起到廢物重新利用的功能，促進環保。

1 實驗材料

1.1 儀器和試劑

紫外分光光度計、高速離心機、水浴鍋、比色皿、小試管、燒杯、量筒。

1.2 實驗材料

酸棗環保酵素、草莓環保酵素、掐不齊環保酵素、獼猴桃環保酵素、西紅柿環保酵素、西瓜環保酵素、番石榴環保酵素、番木瓜環保酵素。

2 實驗方法

2.1 環保酵素制作

分別取酸棗、草莓、掐不齊、獼猴桃、西紅柿、西瓜、番石榴、番木瓜為原料，將質量比為1∶3∶10的果蔬材料（切碎）、紅糖、蒸餾水放入不同密封罐中，早期每天放氣一兩次，1個月后待無氣放出置于陰涼處保存3個月。

2.2 檢測方法

通過測量不同環保酵素在特定條件下的吸光度來計算其對3種自由基（超氧自由基、羥基自由基、DPPH自由基）的清除率，從而判斷其抗氧化能力的強弱。

2.2.1 對羥基自由基的測量方法[2]

在FeSO4、H2O2、水楊酸-乙醇體系中，以水楊酸作為Fenton試劑反應產生的羥基自由基（-OH）的捕捉劑，在加入不同濃度環保酵素的情況下，測定酵素對羥基自由基的清除率。

向比色管中加入蒸餾水1.00 mL，1.8 mmol·L-1 FeSO4溶液2.00 mL，1.8 mmol·mL-1水楊酸-乙醇溶液1.50 mL，最后加入0.03% H2O2 0.10 mL，振蕩混合，在波長510 nm處測定其吸光度值A0。另取比色管，向其中加入不同濃度酵素溶液1.00 mL，FeSO4溶液2.00 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL，最后加0.03% H2O2 0.10 mL，振蕩混合，水浴37 ℃下保溫30 min后在波長510 nm下測量各自的吸光度值Ax，再另取比色管加入相同系列濃度的環保酵素1.00 mL和FeSO4溶液2.00 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL，蒸餾水0.10 mL，在波長510 nm下測量吸光度值Ax0。上述三組試管的反應同時操作進行，以消除時間不均的誤差。

將環保酵素與FeSO4溶液、水楊酸、乙醇、H2O2混合，37 ℃水浴加熱30 min后在波長510 nm處測定其吸光度值。

羥基自由基清除率計算公式為：

式（1）中，A0為蒸餾水在相同條件下的吸光度值；Ax為添加H2O2的環保酵素吸光度值；Ax0為未添加H2O2的吸光度值。

2.2.2 對超氧自由基的測量方法[3]

試管中依次加入0.1 mol·L-1 Tris-HCl溶液4.5 mL、雙蒸水4.2 mL，于25 ℃恒溫20 min后加入25 ℃預熱過的鄰苯三酚（對照管用10 mmol·L-1，鹽酸代替），迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在波長325 nm處每10 s測定一次吸光值A0，計算ΔA0。

試管中依次加入0.1 mol·L-1 Tris-HCl溶液4.5 mL、雙蒸水3.7 mL、環保酵素0.5 mL，于25 ℃恒溫20 min后加入25 ℃預熱過的鄰苯三酚（對照管用10 mmol·L-1，鹽酸代替），迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在波長325 nm處每10 s測定一次吸光值ASOD，計算ΔASOD。

超氧自由基清除率計算公式為：

式（2）中，ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率；ΔASOD：樣品光密度值變化速率。

2.2.3 對DPPH自由基的測量方法[4]

以2 mL蒸餾水+2 mL無水乙醇為空白對照，將2 mL不同濃度酵素液加入到2 mL 20 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液中，混勻后避光處放置30 min后，于波長517 nm處測定吸光度值Ai；同法測定2 mL無水乙醇和2 mL不同濃度酵素體系的吸光度值Aj，以及2 mL無水乙醇和2 mL

20 mmol·L-1的DPPH乙醇體系的吸光度值Ac。

DPPH自由基清除率計算公式為：

式（3）中，Ai為與DPPH-乙醇混合的環保酵素的吸光度值；Ac為無水乙醇與DPPH-乙醇混合后的溶液的吸光度值；Aj為與無水乙醇混合的環保酵素的吸光度值。

3 結果與分析

3.1 同種酵素在不同發酵時間和不同稀釋度下對羥基自由基的清除情況

圖1和圖2分別表示維生含量高和含番茄紅素高的酵素對羥基自由基的清除率。由圖可知，實驗結果大體呈現出隨著酵素稀釋度的增加而明顯減少的趨勢，其中酸棗的變化最為規律，當稀釋度≥50時的清除率相差不大，并且原濃度的清除率遠大于稀釋后的濃度。西瓜對羥基自由基的清除率隨著稀釋度的變化頗為異常，結果與時間的關系密切，6月份的清除率最大，其余時間的結果均過小。清除率隨時間的變化規律多是先減少后上升，6種酵素在10月的清除率達到最大，6種酵素在5月的清除率達到最小。維生素C含量高的酵素普遍變化規律比較平緩，且自由基清除效果略優含番茄紅素高的酵素。

3.2 同種酵素在不同發酵時間和不同稀釋度下對DPPH自由基的清除情況

圖3和圖4分別表示維生素C含量高和含番茄紅素高的酵素對DPPH自由基的清除率。8種酵素對DPPH自由基的清除率大體呈現出隨著稀釋度的增加而明顯減少的趨勢，并且各稀釋度對應的清除率變化幅度較平緩，不同發酵時間下原濃度的清除率變化相差不大，在稀釋50倍后逐漸出現較大變化，并且有5種酵素在5月的清除率最小，6種酵素在10月的清除率最大。維生素C含量高的酵素對DPPH自由基清除效果基本等同于含番茄紅素高的酵素，但含番茄紅素高的酵素變化規律普遍平緩一些。

3.3 同種酵素在不同發酵時間和不同稀釋度下對超氧自由基的清除情況

圖5和圖6分別表示維生素C含量高和含番茄紅素高的酵素對超氧自由基的清除率。以掐不齊為原料的酵素對超氧自由基的清除率大體呈現出隨著稀釋度的增加而明顯減少的趨勢，但是其他酵素的變化趨勢十分異常，維生素C含量高和含番茄紅素高的酵素對超氧自由基的清除率的變化規律均不明顯。

4 結論與展望

在原濃度的情況下，環保酵素對羥基自由基、超氧自由基和DPPH自由基有著良好乃至完全清除作用，且清除能力與原材料關系不大。由于本實驗的稀釋濃度跨度大，要進一步探究環保酵素的最佳濃度還需要在0.2%～100%進行梯度濃度實驗。

本實驗中，維生素C含量較高的果蔬環保酵素對3種自由基的清除作用較好，酸棗酵素對羥基自由基、DPPH自由基的清除能力最好，掐不齊酵素對超氧自由基的清除能力最好。隨著環保酵素稀釋倍數的增加，酵素對自由基的清除能力逐漸下降，時間對清除能力的影響不明顯，進一步實驗需要加長或縮短發酵周期。

實驗中對環保酵素稀釋后的對自由基的清除能力進行實驗，從原濃度稀釋到50倍后清除能力下降最快，提示實際使用中的稀釋濃度應在0～50倍，以免環保酵素效果過低，最佳的稀釋濃度需要進一步實驗，也要考慮實際的需求。

環保酵素在環境污染治理方面的研究剛剛起步，可在環保酵素菌落組成及變化、活性成分分析分離與鑒定、環保酵素對污水COD、總氮、總磷乃至毒害有機污染物的清除效果和機理方面進一步開展研究，為后續環保酵素在環境治理方面的應用提供科學參考。

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（責任編輯：趙中正）