低溫對球孢白僵菌生物學特性及其對韭蛆毒力的影響

周仙紅 范曉杰 曹雨 張思聰 莊乾營 于毅

摘要 本文室內測試了低溫對球孢白僵菌高毒力菌株YB8的生物學特性（菌落生長速率與產孢量）及其對韭蛆毒力的影響。結果表明：在8～25℃溫度范圍內菌落生長速率和產孢量隨溫度的降低而降低。在25℃時菌落生長速率為3.15 mm/d，產孢量為5.94×106個/mm2。20、23℃下菌落生長速率（1.94、2.91 mm/d）與25℃下相比顯著降低（P<0.05），產孢量（4.80×106、5.57×106個/mm2）略有降低，差異不顯著（P>0.05），8～17℃下與25℃相比菌落生長速率及產孢量均顯著降低（P<0.05）。低溫下球孢白僵菌對韭蛆的校正死亡率隨溫度降低而減小，25℃時韭蛆校正死亡率最高，為45.33%，與其他各溫度差異顯著（P<0.05）。因此低溫對白僵菌生長和韭蛆致病力有顯著影響，根據(jù)韭蛆的田間發(fā)生規(guī)律，建議春秋季節(jié)韭蛆盛發(fā)期使用球孢白僵菌防治韭蛆時應在土壤溫度接近或達到25℃時使用。

關鍵詞 球孢白僵菌； 韭蛆； 低溫； 菌落生長； 毒力

中圖分類號： S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017140

Abstract The effects of low temperature on the biological characteristics （colony growth rate and spore yields） of high-virulence strain Beauveria bassiana YB8 and its toxicity against Bradysia odoriphaga were investigated. The results showed that the colony growth rate and spore yields decreased with decreasing temperature in the range of 8-25℃. The highest colony growth rate （3.15 mm/d） and spore yields （5.94×106 spores/ mm2） were recorded at 25℃. The colony growth rates at 20℃ and 23℃ （1.94， 2.91 mm/d） were significantly lower than that at 25℃ （P<0.05）， while the spore yields （4.80×106， 5.57×106 spores/mm2） had no significant difference from that at 25℃ （P>0.05）. The colony growth rate and spore yields in the range of 8-17℃ were significantly lower than those at 25℃ （P<0.05）. Meanwhile， the toxicity of YB8 to B.odoriphaga decreased with decreasing temperature. The highest mortality （45.33%） was recorded at 25℃， which was significantly higher than those at other temperatures （P<0.05）. Based on the occurrence of B.odoriphaga in the field， it was recommended to use B.bassiana in spring and autumn when the soil temperature was close to or above 25℃.

Key words Beauveria bassiana； Bradysia odoriphaga； low temperature； colony growth； toxicity

韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang，屬于雙翅目，長角亞目，眼蕈蚊科，遲眼蕈蚊屬，是蔥蒜類蔬菜的重要害蟲，幼蟲俗稱韭蛆，喜食韭菜根部。韭菜遲眼蕈蚊在田間以幼蟲（韭蛆）為害，春季主要為害植株葉鞘、幼莖和芽，引起幼莖腐爛、葉片枯黃，而后把莖咬斷并蛀入莖內。夏季氣溫較高，幼蟲向下活動，深入鱗莖，造成鱗莖腐爛引起整株死亡。冬季氣溫低，韭菜遲眼蕈蚊以老熟幼蟲越冬[1]。環(huán)境，如溫度、濕度、降水、寄主植物的品種及覆蓋面積是影響昆蟲發(fā)生發(fā)展的主要因素，其中溫度和濕度對韭菜遲眼蕈蚊影響較大，適度低溫和高濕對其生存有利，而過高溫度和濕度或低溫、低濕可降低其存活率[2]。馮惠琴等[3]、梅增霞等[4]研究發(fā)現(xiàn)20～25℃下韭菜遲眼蕈蚊的種群增長指數(shù)和繁殖力較高，說明該溫度范圍是韭菜遲眼蕈蚊的適宜生長溫度，這就是該蟲春、秋季發(fā)生重的原因之一。

球孢白僵菌Beauveria bassiana屬于絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，白僵菌屬，是一種能寄生15目149科700多種昆蟲和蜱螨類的廣譜性的昆蟲病原真菌[5]，因此其被公認為目前世界上防治害蟲應用較廣、最有前途的一種蟲生真菌[6]。蟲生真菌在其生產過程和田間應用中會受到溫度、濕度、光照等環(huán)境因素影響[7]，溫度影響球孢白僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長、產孢繁殖各個生長階段。球孢白僵菌孢子萌發(fā)的溫度范圍為5～35℃[89]，生長速度一般隨溫度的升高而加快，溫度過低對球孢白僵菌的產孢量影響不大，但容易造成孢子萌發(fā)時間推遲、菌絲生長稀疏[1011]。室內外研究發(fā)現(xiàn)，適宜球孢白僵菌孢子萌發(fā)及菌絲生長的溫度，也是防治害蟲的最佳溫度，低溫（17℃以下）或高溫時（29℃以上）會抑制球孢白僵菌生長，導致其殺蟲效果顯著降低[1216]。由于春、秋季是韭蛆為害高峰期，而夏季幾乎不發(fā)生，因此本文選取實驗室儲存的對韭蛆致病力強的球孢白僵菌菌株YB8，研究低溫對球孢白僵菌生物學特性的影響，同時室內測定了低溫下YB8對韭蛆的毒力，旨在為指導田間使用球孢白僵菌防治韭蛆的溫度范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：球孢白僵菌Beauveria bassiana自亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis上分離獲得，經篩選后獲得對韭蛆高毒力菌株YB8。菌株保存于山東省農業(yè)科學院植物保護研究所4℃冰箱中。使用前用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）在恒溫箱中培養(yǎng)形成菌落，培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，光周期L∥D=0 h∥24 h。

供試昆蟲：韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang采自山東壽光韭菜田，并于山東省農業(yè)科學院植物保護研究所養(yǎng)蟲室內用人工飼料[17]連續(xù)飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對濕度70%±5%。試驗選用健康活潑的3齡幼蟲。

1.2 試驗方法

1.2.1 低溫對球孢白僵菌菌株YB8的菌落生長速率和產孢量的影響

將球孢白僵菌在PDA培養(yǎng)基上活化10 d左右，用直徑5 mm的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉接到PDA平板中央，分別置于不同溫度（8、11、14、17、20、23和25℃）恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，每處理5個重復。采用十字交叉法[12]測量菌落直徑，每24 h測定1次，共測量10 d，計算菌落生長速率。10 d后用直徑5 mm的滅菌打孔器從菌落中心距離邊緣1/2處打取菌餅，每個處理取3個菌餅，接入15 mL 含0.05%吐溫-80的無菌水中，攪拌使孢子充分分散，制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板測定孢子濃度，并計算出每平方毫米的產孢量。

菌落增長直徑（mm）=菌落直徑-菌餅直徑（5 mm）；

菌落生長速率（mm/d）=菌落增長直徑/培養(yǎng)時間（10 d）；

產孢量（個/mm2）=孢子數(shù)/（mL）×15/（π×半徑2）

1.2.2 低溫下球孢白僵菌YB8對韭蛆的毒力測定

將韭菜假莖剪成1 cm小段放入1×108個/mL的孢子懸浮液中浸泡5 min后放入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底層用瓊脂和濾紙進行保濕，在濾紙上滴加600 μL 1×108個/mL的孢子懸浮液，每皿接入30頭健康、活潑的韭菜遲眼蕈蚊3齡幼蟲，每處理重復5次，同時設無菌水對照。分別放入8、11、14、17、20、23和25℃，RH =70%±5%，全黑暗恒溫箱中飼養(yǎng)，11 d后記錄死亡蟲數(shù)，計算校正死亡率，并收集活蟲。以毛筆尖輕觸蟲體，幼蟲不動或身體明顯收縮為死亡，記錄死亡蟲數(shù)并計算校正死亡率。

校正死亡率=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對不同處理間的差異進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukeys-b（K）氏多重比較（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 低溫對球孢白僵菌菌落生長速率和產孢量的影響

以25℃作為對照溫度，研究低溫對球孢白僵菌生長速率和產孢量的影響。表1數(shù)據(jù)結果表明：7個溫度下球孢白僵菌均能生長。25℃時菌落生長速率達到最高，為3.15 mm/d，10 d菌落直徑擴展了31.5 mm。球孢白僵菌菌落生長速率隨溫度的降低而明顯降低（F=206.901，df=6，P=0.000）。8℃時菌落生長速率最低，為0.19 mm/d。球孢白僵菌的產孢量隨溫度的降低而減少，25℃、23℃時與20℃時的產孢量分別為5.94×106、5.57×106、4.80×106個/mm2，且三者相比差異不顯著（F=11.617，df=6，P=0.176），8～17℃產孢量與25℃相比明顯減少（F=11.617，df=6，P=0.000），其中8℃產孢量最低，為0.89×106個/mm2。因此在供試溫度范圍內，25℃相比其他溫度最適合球孢白僵菌YB8的生長。

2.2 低溫下球孢白僵菌對韭蛆的毒力

表2試驗結果表明，接種球孢白僵菌后韭蛆校正死亡率隨溫度的降低而明顯降低。

25℃時接種后11 d韭蛆校正死亡率達到最高，為45.33%，與其他溫度差異顯著（F=214.652，df=6，P=0.000），8、11及14℃下接種后11 d韭蛆校正死亡率為0，而20℃和23℃時韭蛆校正死亡率分別為24.67%、29.33%，兩者之間差異不顯著（F=214.652，df=6，P=0.678）。因此在供試溫度范圍內，25℃相比其他溫度球孢白僵菌對韭蛆致病力更強。

3 結論與討論

關于白僵菌對昆蟲的毒力研究較多的有蚜蟲、粉虱、菜粉蝶、玉米螟等[18]。已有的研究表明，白僵菌生長發(fā)育不同時期（如菌絲生長期和產孢期）的最適溫度不盡相同。本試驗結果表明，供試溫度范圍內最適合球孢白僵菌生長發(fā)育的溫度為25℃，從最低生長溫度開始，隨著溫度的升高生長速度提高，產孢量增加，這與前人的研究結果基本一致[7，1213，19]。在一定的溫度范圍內，白僵菌的侵染力隨溫度升高而增強[20]，這與本文中25℃時白僵菌孢子萌發(fā)率最高、萌發(fā)速度最快及對韭蛆的毒力最強的結果一致。

根據(jù)韭蛆的田間發(fā)生規(guī)律[3]以及白僵菌對低齡韭蛆毒力更高這一特點，田間可在春季和秋季韭蛆低齡幼蟲[21]時期使用白僵菌，此時山東地區(qū)土壤5 cm深度周平均溫度為18.5～22.8℃[22]。由于20～23℃下球孢白僵菌對韭蛆的致死率較低，可以加大白僵菌的使用量，這樣既保證了白僵菌的最優(yōu)生長條件，又提高了防治效果。雖然低溫下白僵菌對當代韭蛆的毒力較低，但白僵菌孢子在韭蛆體內仍能繁殖、累積，并能垂直傳播到下一代[2324]，從而實現(xiàn)持續(xù)控制害蟲的目標，白僵菌對下一代韭蛆的影響有待進一步研究。

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（責任編輯：楊明麗）