PMA—qPCR定量檢測青枯菌活菌方法的建立

王帥 徐進 許景升

摘要 本文將疊氮溴化丙錠（PMA）與熒光實時定量PCR技術相結合，建立了一種適于青枯菌不同小種菌株活細胞精準、快速檢測的PMA-qPCR方法。通過單因素變化試驗對PMA預處理反應體系中的各參數進行優化，確立了PMA終濃度為15 ng/μL，黑暗孵育時間為10 min，曝光時間為5 min的PMA預處理體系。試驗結果表明，當活菌比例大于10%，PMA-qPCR的測定結果均在理論活菌數相對應的95%置信區間內。檢測靈敏度測試結果顯示，該方法適用于活菌數在5.0×10.2～5.0×10.8 cfu/mL范圍內菌懸液的檢測。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范圍內有效去除青枯菌死菌的干擾，定量檢測出活菌數量，研究結果可為植物細菌性青枯病的流行規律研究提供新的技術支撐。

關鍵詞 PMA-qPCR； 青枯菌； 活菌檢測

中圖分類號： S 435.32

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017483

Abstract By combining propidium monoazide （PMA） with fluorogenic （TaqMan） PCR， we developed a novel method for specific detection of viable cells ofRalstonia solanacearum at species level. We optimized various parameters of PMA by single factor change test to establish the system of PMA pre-treatment. The optimal conditions for PMA-qPCR were： a final concentration of PMA of 15 ng/ mL， a dark incubation time of 10 min， and an exposure time of 5 min. The test results showed that， within the range of 50×10.2-5.0×10.8 cfu/mL， when the proportion of viable bacteria was greater than 10%， the results of PMA-qPCR were almost identical with the theoretical values. The method could effectively remove the interference of the dead cells ofR.solanacearum and quantitatively detect the number of viable cells， thereby providing a new technical support for the research of epidemiology of bacterial wilt caused byR.solanacearum.

Key words PMA-qPCR； Ralstonia solanacearum； viable cell detection

植物細菌性青枯病（bacterial wilt of plants）是由茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum Yabuuchi（簡稱青枯菌）引起的一種世界性重大病害。青枯菌菌系復雜，寄主范圍廣泛，可侵染包括馬鈴薯、生姜、番茄、辣椒等重要經濟作物在內的54科450余種植物[1-2]。青枯病是熱帶、亞熱帶以及溫帶某些地區農業生產的重要限制因子，且近幾十年來，該病逐漸向高緯度、冷涼區域擴散蔓延[3]。迄今為止，青枯病的有效防控仍是難以突破的世界性瓶頸問題。建立精確、靈敏、高效的早期診斷技術，是有效阻斷青枯病傳播擴散，制定科學防控策略的基石。2001年，Grey等首次報道了銅制劑可誘導青枯菌進入活的非可培養（viable but nonculturable， VBNC）狀態[4]，VBNC狀態的青枯菌失去了在傳統培養基上生長繁殖的能力，因此采用常規平板培養方法會造成假陰性檢測結果[4]；而常規的PCR檢測技術不僅能擴增活菌細胞DNA，也會擴增死菌細胞DNA以及游離狀態的DNA分子，致使假陽性結果的產生。目前已報道的青枯菌活菌檢測主要基于膜完整性的檢測方法和基于代謝活性的檢測方法。基于膜完整性的檢測方法主要分為兩類，一類是用SYTO9和碘化丙啶（PI）對青枯菌染色后結合熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡或流式細胞儀進行檢測[4-9]；另一類是用疊氮溴化丙錠（propidium monoazide， PMA）或疊氮溴化乙錠（ethidium monoazide bromide， EMA）預處理，再通過PCR或qPCR進行檢測[10-12]。這兩類檢測方法是目前青枯菌VBNC研究中常用的方法。基于代謝活性的檢測較為經典的方法有CTC法和DVC法[4-5，13]。本研究以VBNC狀態青枯菌的定量檢測為出發點，利用PMA對活/死細胞具有選擇性的特性，將PMA與熒光定量PCR相結合用于青枯菌活菌檢測。對PMA作用于青枯菌的最佳濃度、黑暗孵育時間以及曝光時間進行摸索。本文針對樣品中活的以及VBNC狀態的青枯菌，旨在建立一種快速、靈敏、特異性強且可定量檢測青枯菌的方法，藉此為帶菌植物繁殖材料的檢測與青枯病防治效果評價提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

番茄品種‘中雜106號購自北京中農良種公司；供試的青枯菌Z-Aq-1菌株由筆者實驗室分離、保存。

疊氮溴化丙錠（PMA）購自美國Biotium公司；Probe qPCR Mix購自TaKaRa公司；650 W鹵鎢燈購自德國Osram公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystem公司； SPECORD40紫外分光光度計購自德國Analytik Jena AG公司；INFORS Ecotron 振蕩培養箱購自瑞士INFORS公司；Memmert IN55培養箱購自德國美爾特公司。

NB （nutrient broth）培養基：葡萄糖10 g，多聚蛋白胨5 g，牛肉浸膏3 g，酵母提取物0.5 g，用蒸餾水定容到1 000 mL，調節pH=7.0，121℃滅菌20 min。固體培養基加1.8%瓊脂。改良的選擇性NA培養基（mNA）：NB 培養基中添加多黏菌素（polymixin-B-sulphate）至終濃度20 mg/mL，桿菌肽（bacitracin）至終濃度5 mg/mL，氯霉素（chloramphenicol）至終濃度1 mg/mL，青霉素（penicillin-G）至終濃度5 mg/mL，TZC存儲液[1%紅四氮唑（C19H15ClN4）115℃滅菌7～8 min]至終濃度50 mg/L。抗生素在培養基45～50℃時加入。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液制備

使用接種環蘸取室溫下保存在無菌水中的Z-Aq-1菌懸液， 于mNA培養基上劃線。 28℃條件下培養48～72 h后， 挑取典型的青枯菌野生型菌落， 經PCR驗證后轉至普通NA培養平板。28℃條件下培養48～72 h后， 挑取菌膿于NB液中28℃振蕩培養至A600=0.8～1.0（菌懸液濃度為1.0×10.9～3.0×10.9 cfu/mL）。取1 mL上述菌液至1.5 mL離心管中， 12 000 r/min， 離心5 min，棄上清，等體積無菌水反復洗滌3次后，懸浮于1 mL無菌水中， 100℃水浴30 min， 獲得熱滅活的死菌細胞懸浮液。

1.2.2 PMA質量濃度的優化

稱取1 mg PMA溶解于200 μL 20%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，得到質量濃度為5 μg/μL的貯存液， 于-20℃保存。使用前將貯存液稀釋為0.5 μg/μL的工作液。將不同體積的PMA工作液添加到500 μL濃度為10.9 cfu/mL的活菌菌懸液中， 充分混勻，獲得PMA 最終質量濃度分別為0、5、10、15 和20 ng/μL；同樣方法對熱滅殺的死亡菌體懸浮液進行處理。將全部處理的菌懸液置于黑暗處孵育10 min， 隨后，開蓋向上置于冰上， 在距離650 W鹵鎢燈15 cm處均勻曝光5 min， 曝光結束后， 取4 μL 菌體懸浮液作為模板分別進行熒光定量PCR。通過7500 Software V 2.3 采集循環閾值（cycle threshold，Ct） 。每次試驗設5個平行樣，每個樣品3個重復，每組試驗重復3次。

1.2.3 PMA預處理黑暗孵育時間的優化

分別添加PMA工作液于500 μL 10.9 cfu/mL活菌菌懸液和熱滅活死菌菌懸液中，充分混勻，獲得PMA最終質量濃度為15 ng/μL，隨后置于黑暗處孵育。設置孵育時間為0、2、5、10 和15 min，其后的操作步驟同1.2.2。每次試驗設5個平行樣，每個樣品3個重復，每組試驗重復3次。

1.2.4 PMA預處理最優曝光時間的選擇

分別添加PMA工作液于500 μL 10.9 cfu/mL活菌菌懸液和熱滅活死菌菌懸液中，充分混勻，獲得PMA最終質量濃度為15 ng/μL，置于黑暗處孵育10 min后，開蓋向上置于冰上，在距離650 W鹵鎢燈15 cm處分別均勻曝光0、2、5、10 和15 min，其后操作步驟同1.2.2。每次試驗設5個平行樣，每個樣品3個重復，每組試驗重復3次。

1.2.5 熒光PCR檢測體系

利用ABI 7500 Real-Time PCR儀進行檢測。參考Weller等[14]的報道合成引物和探針。上游引物RS-I-F：5′-GCATGCCTTACACATGCAAGTC-3′；下游引物RS-II-R：5′-GGCACGTTCCGATGTATTACTCA-3′。Taqman探針RS-Pb的5和3端分別以熒光報告基團（FAM）和淬滅基團（TAMRA）進行標記 （5′-FAM-AGCTTGCTACCTGCCGGCGAGTG-TAMRA-3′）。引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。反應體系（50 μL）為：Probe qPCR Mix（2×）25 μL， 上游引物（10 μmol/L） 1 μL，下游引物 （10 μmol/L） 1 μL，探針2 μL，ROX DyeⅡ （50×）0.5 μL，模板4 μL，超純水16.5 μL。反應條件為：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 1 min （收集熒光信號），共40個循環。

1.2.6 PMA-qPCR檢測不同比例的活菌

將熱滅活死菌與同濃度活菌按不同比例混合以制得活菌占比分別為0、10%、20%、50%、80%、90%、100%的活菌/死菌混合液，待測。

另取1 mL處于對數期的新鮮活菌（A600=0.8～1.2）于1.5 mL離心管中，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，等體積無菌水反復洗滌3次后，懸浮于1 mL無菌水中，10倍梯度進行系列稀釋，分別得到稀釋10.0、10.1、10.2、10.3、10.4倍的菌懸液，作為建立標準曲線的樣品液。

吸取500 μL待測活菌/死菌混合液和標準樣品液按照優化條件進行PMA預處理。隨后取4 μL菌懸液作為模板進行熒光定量PCR。同時，分別取100 μL不同稀釋倍數的樣品液涂布平板，用以計算樣品液中的活菌數。根據熒光定量PCR后7500 Software V 2.3 采集的不同比例活菌菌懸液的Ct值，結合標準曲線，計算得到不同比例活菌/死菌混合液中的活菌數。每次試驗設3個平行樣，每組試驗重復3次。

1.2.7 PMA-qPCR靈敏度檢測

濃度為1.0×10.9 cfu/mL的活菌及熱滅活死菌菌懸液同體積混合后，依次進行10倍梯度稀釋，分別獲得濃度為5.0×10.8、5.0×10.7、5.0×10.6、5.0×10.5、5.0×10.4、5.0×10.3、5.0×10.2、5.0×10.1、5.0×10.0cfu/mL的待測菌懸液。同時，如1.2.6所述建立標準曲線。通過7500 Software V 2.3 采集不同處理菌懸液的Ct值，并根據標準曲線計算得到不同混合液中的活菌數。每次試驗設3個平行樣，每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 PMA預處理反應體系優化

2.1.1 PMA質量濃度的優化

使用PMA對青枯菌活菌進行預處理時，隨著PMA處理濃度的增加，活菌擴增的Ct值無顯著變化（圖1），這是因為活菌的細胞膜完整，而PMA不能透過完整的細胞膜與細胞內的DNA分子結合。而使用PMA對熱滅活死菌進行預處理時，當PMA的濃度在0～15 ng/μL時，隨著PMA處理濃度的升高，擴增的Ct值顯著增加，這是因為低濃度的PMA不能完全與死菌細胞的DNA結合，從而不能最大限度地抑制死菌細胞的DNA擴增。當PMA濃度為20 ng/μL時與15 ng/μL無顯著差異，說明PMA濃度為15 ng/μL時已可最大限度地抑制死菌細胞DNA的擴增。因此，選擇15 ng/μL作為PMA預處理的最優濃度。

2.1.2 PMA預處理黑暗孵育時間的優化

黑暗孵育時間優化試驗表明，隨著黑暗孵育時間的延長，活菌擴增的Ct值無顯著變化（圖2），這是因為PMA不能進入到活細胞內與DNA分子結合，而在隨后的曝光處理過程中被光解，并未對后續的熒光定量PCR產生影響。而使用PMA對熱滅活死菌進行預處理時，當黑暗孵育時間小于10 min時，隨著孵育時間的延長，擴增的Ct值顯著增加，這是因為在黑暗孵育過程中，隨著時間的延長，PMA與熱致死細胞DNA的交聯結合率升高，從而對死細胞DNA擴增的抑制作用增強，而黑暗孵育10 min與15 min的Ct值無顯著差異，說明黑暗孵育10 min可使得PMA與熱致死細胞的DNA最大程度地結合，從而有效避免死細胞DNA的擴增。因此，選擇10 min作為PMA預處理的最優黑暗孵育時間。

2.1.3 PMA預處理最優曝光時間的選擇

由圖3可知，使用PMA對活菌進行預處理時，當曝光時間小于5 min時，隨著曝光時間的延長，Ct值逐漸降低，這是因為曝光時間過短，不能使殘留的PMA完全光解，從而對后續的熒光定量PCR產生抑制作用，而曝光時間大于5 min時，各處理活菌的Ct值無顯著差異，說明曝光時間大于5 min，可使殘留的PMA完全光解從而消除殘留PMA對后續qPCR的影響。使用PMA對熱滅活死菌進行預處理時，當曝光時間小于5 min時，隨著曝光時間的延長，Ct值逐漸增加，這是因為曝光時間增加，殘留PMA的光解率升高，對DNA擴增的抑制作用減弱，而曝光時間大于5 min時，各處理死菌的Ct值無顯著差異，進一步說明曝光5 min足以使殘留的PMA完全光解。因此，選擇5 min作為PMA預處理的最優曝光時間。

2.2 PMA-qPCR檢測不同比例的活菌

將處于對數期的新鮮活菌懸液（濃度約為10.9 cfu/mL），10倍梯度稀釋，得到活菌濃度梯度為10.5 ～10.9 cfu/mL的活菌菌懸液，再進行PMA-qPCR，活菌細胞數量與Ct的相關性如圖4所示。由Ct值與不同活菌濃度產生的線性回歸表明，兩者之間具有明顯的相關性（R.2=0.999），且擴增效率良好（Eff%： 91.577），由PMA-qPCR標準曲線擴增峰圖（圖5）也能更直觀地看出應用此方法構建標準曲線重復性和穩定性良好。

由表1可知，當理論活菌比例為0%，理論活菌數為0 cfu/mL時，PMA-qPCR的測定結果為10.6 cfu/mL與理論值存在極顯著差異，且理論值不在對應的95%置信區間內。而當理論活菌比例分別為10%、20%、50%、80%、90%、100%時，PMA-qPCR的測定結果與理論活菌數均在同一數量級，且理論活菌數均在相對應的95%置信區間內。由圖6可以看出，當活菌比例大于10%時，理論值與實測值之間呈良好的線性關系，這說明，當活菌比例在10%～100%時，應用該方法完全可以估計青枯菌的活菌數量，但當活菌比例小于10%，且死菌的濃度大于10.3 cfu/mL時，應用該PMA-qPCR檢測活菌數量可能會出現假陽性結果。

2.3 PMA-qPCR檢測青枯菌活菌的靈敏度

由表2可知，當理論活菌數為5.0×10.2～5.0×10.8cfu/mL之間時，PMA-qPCR測定結果顯示：活菌數雖與理論活菌數不完全一致，但均維持在相對應的數量級上，且理論活菌數均在相對應的95%置信區間內。而當理論活菌數小于等于5.0×10.1cfu/mL時，PMA-qPCR測定結果顯示的活菌數遠高于理論值，且理論活菌數不在相對應的95%置信區間內（表2）。由圖7可知，活菌濃度在5.0×10.2～5.0×10.8cfu/mL時，理論值與實測值之間有良好的線性關系，說明當活菌濃度在5.0×10.2～5.0×10.8cfu/mL范圍內時，應用PMA-qPCR方法檢測可以較客觀地反映實際活菌數量，根據回歸方程y=0.991 3x+0.015 1，也可計算出更接近理論值的活菌數量，而當活菌濃度小于5.0×10.2 cfu/mL時，應用該反應體系檢測青枯菌活菌數量則受到局限。

3 討論

近年來，隨著我國馬鈴薯、生姜和番茄等作物種植面積的不斷擴大，集約化生產水平的逐步提高，青枯病已成為我國常見、易發和傳播迅速的重要土傳病害之一[15-16]。目前國內南起20°N的海南省、北至42°N的河北壩上地區均有該病發生危害的報道[17]。然而青枯病的防治，迄今仍是生產實際中有待突破的難題之一。青枯菌在脫離寄主植物的土棲生活過程中，可能通過進入VBNC狀態以應對干旱、寡營養和重金屬等逆境脅迫，并在其成功完成侵染循環過程中發揮著重要作用。常規分離培養和分子檢測方法，或因青枯菌的VBNC狀態而造成假陰性檢測結果，或因死亡菌體細胞釋放出的游離DNA造成假陽性結果。因此，建立精準、可靠的青枯菌活細胞定量檢測方法，對于深入探究青枯病的生態流行學規律，阻斷疫情隨帶菌植物繁殖材料擴散傳播，篩選評價不同防控策略的效果具有重要意義。

作為光敏DNA染料，PMA和EMA均無法進入具完整細胞膜結構的菌體內，但可與游離DNA通過共價氮碳鍵穩定結合，進而抑制隨后的基于DNA擴增技術的分子檢測陽性信號的產生。利用這一原理，Nogva等[18]2003年首次報道了基于EMA-qPCR技術的大腸桿菌Escherichia coli、沙門氏菌Salmonella spp.和單增李斯特菌Listeria monocytogenes的活菌定量檢測技術。此后該方法被廣泛應用于醫藥衛生、食品工業和環境科學等諸多研究領域的病原微生物和環境活菌的檢測，2008年Luo等[19]首次將EMA-qPCR技術應用于植物病原細菌學研究領域，建立番茄細菌性潰瘍病菌Clavibacter michiganensissubsp. michiganensis的活菌定量檢測方法。2013年熊書等[12]建立了針對青枯菌的EMA-qPCR活體檢測方法，可以定量區分出青枯菌死亡菌體細胞和處于VBNC狀態的細胞。近年來，越來越多的相關研究表明EMA可進入某些種類細菌的活細胞內，并與DNA分子結合，使其不僅抑制死細胞PCR擴增，也抑制活細胞PCR擴增。反之，PMA較EMA多一個正電荷，更難于進入細菌活體細胞內，使得PMA在選擇性抑制死細胞PCR擴增方面更具優勢[20-21]。

近年來，基于PMA的PCR或qPCR技術已成為檢測細菌活菌的研究熱點。在青枯菌研究領域，曹夢琪等[11]建立了青枯菌5號生理小種的PMA-qPCR定量檢測方法，2016年于小龍等[10]將PMA與PCR技術相結合，建立了一種快速有效區分青枯菌死/活細胞的分子檢測方法。但這兩種基于PMA的檢測方法均存在一定的局限性，前者僅針對青枯菌5號小種的活菌檢測，對其他小種菌株無效；后者無法實現樣品活菌細胞的定量檢測。

作為復合種，青枯菌群體異常復雜多樣，為確保檢測方法的特異性與通用性，本研究基于歐洲和地中海植物保護組織和美國農業部青枯菌檢測規程中推薦使用的TaqMan檢測方法[14]，結合PMA預處理建立了一種適用性更廣、靈敏度更高的青枯菌活菌定量檢測體系。Weller等[14]的研究結果中顯示RS-I-F/RS-II-R適合青枯菌所有生理小種和生化變種的qPCR檢測，我們在前期試驗中選取了具有代表性且在Weller等研究中未提到的1號小種GMI1000、2號小種Po82、3號小種Po41、4號小種Aq以及5號小種M7等菌株進行了引物通用性驗證，結果表明RS-I-F/RS-II-R適用于5個小種的PCR擴增，為了節約試驗的周期和成本，我們選取侵染生姜的4號小種Aq菌株作為本次試驗的研究對象。相比于SYTO9 和PI染色后通過顯微觀察的檢測方法只適用于純培養青枯菌的活/死菌計數，該方法具有明顯的特異性，可以排除非靶標菌的干擾，因此適用性和實用性更強。本研究結果顯示，PMA終濃度為15 ng/μL，是抑制10.9 cfu/mL 濃度青枯菌死菌的最優濃度，黑暗處理10 min為PMA的最優孵育時間，鹵素燈下曝光5 min為去除殘留PMA分子的最優曝光時間。以上結果與曹夢琪等建立的青枯菌5號小種PMA預處理體系基本一致[11]；與熊書等建立的青枯菌EMA預處理體系相比，黑暗孵育時間有所延長，曝光時間有所縮短[12]，這可能與使用的染料以及菌液濃度有關。在死、活菌混合體系中， 本研究建立的PMA-qPCR檢測方法的青枯菌活菌檢測下限為5.0×10.2 cfu/mL，靈敏度略高于熊書等報道的5.0×10.0個/反應（2.5×10.3 cfu/mL）以及曹夢琪等報道的10.3 cfu/mL[11-12]。本研究使用PMA-qPCR檢測不同比例的活菌時，當活菌濃度為0 cfu/mL，死菌濃度為1.0×10.9 cfu/mL時，PMA-qPCR的定量檢測結果為2.64×10.6 cfu/mL，與理論值差異顯著。Li等在運用PMA-qPCR 法檢測沙門氏菌屬時發現PMA 對死細胞DNA擴增的抑制效果與靶基因擴增長度之間存在良好的相關性，擴增片段長度越長，對死菌DNA抑制效果越好，擴增的基因片段較短時無法完全抑制高濃度死菌DNA的擴增[22]，這可能是造成上述現象的原因之一。但該現象并不影響PMA-qPCR在一定范圍的實際應用，當活菌的百分比大于1%或死菌比例小于99%時，使用該方法完全可以準確地測定青枯菌活菌的數量。

綜上所述，目前青枯菌活菌的檢測主要包括SYTO9和PI結合熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡或流式細胞儀、PMA/EMA結合PCR或qPCR的檢測方法，這些方法各有利弊，當前單一方法由于在某種程度上缺乏一定的科學性，因此為了更準確地在樣品中檢驗出活的以及VBNC狀態細菌，就需要結合多種方法從多種判斷角度更加完整準確地進行驗證。

4 結論

本研究建立的PMA-qPCR檢測方法能從混合狀態下的純培養菌中特異性定量檢測出青枯菌的活菌數量， 為青枯菌活菌以及VBNC狀態菌的檢測提供了科學的參考依據，為植物繁殖材料的帶菌檢測與青枯病防控效果評價提供可靠的技術支撐。

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（責任編輯：楊明麗）