辣椒對疫霉抗性的快速鑒定

赫衛(wèi) 張慧 王瑩

摘要 研究發(fā)現(xiàn)葉、莖、莖基部和果實接種4種方法均能用于鑒定辣椒對辣椒疫霉的抗性。葉與莖接種法操作簡單，接種部位發(fā)病快，可同時檢測大量品種，但要求空氣濕度大；莖基部接種法模擬田間病害的發(fā)生過程，最能反映品種的真實抗性，但需要菌量大，工作量也大；果實接種法不僅操作簡單、接種部位發(fā)病快、菌需求量小，而且可同時篩選大量品種，可以通過量化達到有效區(qū)分抗病和感病品種的目的，更具有完整保存原有植株的優(yōu)勢。

關鍵詞 辣椒疫病； 抗病性； 鑒定

中圖分類號： S 436.418

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017261

Abstract By comparing different methods of leaf， stem， stem base and fruit inoculation， it was found that all the four methods could be used to identify the resistance of pepper to Phytophthora capsici. Leaf and stem inoculation methods are simple in operation and quick in infection， and could be used to detect a large number of varieties at the same time， but the high air humidity is required. The inoculation in stem base basically simulates the occurrence of field disease， which can reflect the real resistance of cultivars， but large amount of fungus and workload are required. Fruit inoculation method is not only simple in operation， quick in infection， small in inoculum size demand， but also can screen a large number of varieties at same time. The fruit method can be used for the effective distinction between resistant and susceptible varieties by quantifying， and has the advantage of preserving the original plant.

Key words Phytophthora capsici； resistance； identification

由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起的辣椒疫病已成為影響辣椒生產(chǎn)的主要病害之一，其主要特征是發(fā)病周期短，流行速度快，發(fā)病面積大。病原菌通過孢子囊萌發(fā)產(chǎn)生的游動孢子侵入植物的根、莖、葉、花和果實[1]。游動孢子除主要通過雨水或灌溉水在土壤中傳播并引起大面積死苗外，還可以通過氣流傳播。目前，抗病品種的選育和推廣是控制辣椒疫病的主要手段。而抗性鑒定常采用的接種方法為離體葉片接種[23]和游動孢子液灌根接種[3]。雖然這兩種接種方法均可以區(qū)分不同辣椒品種對辣椒疫霉的反應，但是這兩種方法卻都有著自身無法克服的缺點，比如：離體葉片接種法是依據(jù)病斑面積占葉面積的比例作為病情分級標準的，由于品種間葉片面積相差較大，因此在接種量一樣的情況下，根據(jù)病斑面積進行比較就無法反映出品種的抗性，同時離體葉片法不適宜進行量化，因而不好分級，只能進行初步的鑒定；游動孢子液灌根接種法基本上是模擬田間病害的發(fā)生過程，能反映品種的真實抗性，但是需要培養(yǎng)孢子，尤其是當鑒定的品種數(shù)量較多的時候，需要大量的孢子，工作量大，操作較復雜。為了獲得簡單有效的方法鑒定辣椒對疫霉的抗性，本試驗用4種不同的方法，為選擇合適的辣椒抗疫病品種的篩選方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取8份辣椒品種或品系為試材。播種前用52～55℃的溫水浸種30 min，1%硫酸銅溶液浸泡5 min進行種子消毒處理，然后用清水沖洗干凈，再浸種催芽后播種至穴盤內(nèi)。葉、莖和莖基部接種法在辣椒的4～6葉期接種。

1.2 辣椒疫霉的培養(yǎng)

將在室內(nèi)低溫保存的辣椒疫霉菌種接種在燕麥固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，在25～28℃下恒溫暗培養(yǎng)3 d至白色菌絲充分生長繁殖布滿整個培養(yǎng)基表面，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，然后在25～28℃恒溫下光/暗交替培養(yǎng)7 d至產(chǎn)生孢子囊。用無菌水沖洗后4℃放置30 min即可用于葉和莖接種法，孢子濃度為1 000孢子/mL。

1.3 接種方法

1.3.1 葉接種法

選取4～6葉期健康的活體植株頂端展開葉，用滅菌刷子在葉片正面上制造淺細傷口，將制備好的菌液用刷子刷在葉片上。每個品種接10株，重復3次，共30株。在溫室自制玻璃箱內(nèi)接種及培養(yǎng)，自然光照，溫度25～30℃，相對空氣濕度90%～95%，以滅菌水為對照，接種后每隔24 h調(diào)查記錄1次發(fā)病情況。

1.3.2 莖接種法

選取4～6葉期健康的活體植株子葉上部莖，用滅菌接種針劃破表皮制造3個傷口，將制備好的菌液用滅菌刷子刷在傷口上，用塑料薄膜包扎保濕24 h后除去薄膜。培養(yǎng)條件同1.3.1。

1.3.3 莖基部接種法

選取4～6葉期健康無病的活體植株莖基部，將菌塊埋在距植株1 cm土壤0.5 cm深處，適時澆水以保持土壤濕度達到飽和。培養(yǎng)條件同1.3.1。

1.3.4 果實接種法

選取健康完整青果期的辣椒果實用滅菌水沖洗后，再用乙醇沖洗滅菌，在鐵盤內(nèi)墊上雙層濕濾紙，將辣椒果實放在上面，用滅菌刀片在果實上切去直徑7 mm表皮，從準備好的菌盤上切割邊長5 mm的菌餅，將菌餅有菌絲的一面緊貼在傷口上，在30℃光照16 h后，25℃黑暗培養(yǎng)8 h，采用保鮮膜覆蓋在鐵盤上面保濕，促使病害的發(fā)生。以不含菌的培養(yǎng)基為對照。

1.4 調(diào)查標準

葉、莖、莖基部接種3種方法不適宜進行分級，只能進行定性觀察。果實接種法調(diào)查標準分5級（圖1）：0級，無病斑；1級，果面上出現(xiàn)水浸狀病斑，病斑直徑≤2 cm；2級，果面上出現(xiàn)水浸狀病斑，2 cm<病斑直徑<4 cm；3級，果面上的水浸狀病斑已嚴重變軟，果表皮與果肉分離，病斑直徑≥4 cm；4級，果面上的水浸狀病斑已完全或幾乎覆蓋果實表面。

病情指數(shù)=∑（各級病果數(shù)×相對級值）/（調(diào)查總果數(shù)×最高級值）×100；

抗病性劃分標準：抗病（R），病情指數(shù)≤15；中抗（MR），15<病情指數(shù)≤30；中感（MS），30<病情指數(shù)≤50；感病（S），病情指數(shù)>50。

2 結果與分析

2.1 葉接種后的發(fā)病情況

接種后5 d即可發(fā)病。抗病植株傷口處變褐，病斑比傷口略大，并不再向外擴展（圖2b）。感病植株先在傷口處形成褐色病斑，逐漸發(fā)展，葉片病斑變黑，整個葉片皺縮萎蔫，病斑沿葉柄向莖擴展，直至根部，造成整個植株萎蔫，最后死亡（圖2c～d）。對照在傷口處變白，沒有任何病變（圖2a）。

2.2 莖接種后的發(fā)病情況

接種后5 d即可發(fā)病。抗病植株僅傷口處變褐縊縮，病斑并不向外擴展（圖2f），莖部的局部病變縊縮有可能使傷口上部的組織整體掉落，留下斷莖。感病植株在切口處形成黑褐色病斑，病斑沿莖稈向上和向下擴展，直至根部，造成植株萎蔫，最后死亡（圖2g～h）。對照在傷口處變白，沒有任何病變（圖2e）。在接種后20 d，抗病植株在留下的斷莖上生出新的葉片，植株繼續(xù)生長，說明這些抗病植株對辣椒疫病有一定的耐受性。

2.3 莖基部接種后的發(fā)病情況

接種后10 d發(fā)病，抗病植株莖基部變褐，病斑并不擴展（圖2j）。感病植株在莖基部形成黑褐色病斑，莖基部變黑縊縮，病斑沿莖稈擴展，造成植株萎蔫，最后死亡（圖2k～l）。對照在莖基部沒有任何變化（圖2i）。

2.4 果實接種后的發(fā)病情況

接種后3 d，有少數(shù)幾份品種開始發(fā)病，第5天時全部品種都表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，但也有一些品種的部分辣椒果實未發(fā)病。發(fā)病初期，疫霉從切口處開始擴散，先在果內(nèi)長出少量菌絲，隨后果外出現(xiàn)水浸狀病斑，當果內(nèi)長出大量菌絲，果外水浸狀病斑迅速擴展，果實剖面呈褐色，病果果肉松軟，直至果皮和果肉分離，徹底腐爛，菌絲在傷口處或果柄處外露（圖3）。對照在切口處干枯，無發(fā)病癥狀。

果實接種法可以很好地區(qū)分抗病和感病品種。抗病品種在切口處無病斑，或切口周圍變褐，病斑向外略有擴展即被遏制，病斑擴展緩慢，而感病品種則在切口處形成水浸狀褐色病斑，病斑向外擴展，造成果肉和果皮分離，直至整個果腐爛。

應用果實接種法可以區(qū)分辣椒品種對疫病抗性。不同品種抗病性呈現(xiàn)明顯不同（圖4）。選取其中8個品種進行鑒定，根據(jù)病情指數(shù)與抗病性的關系，可以判斷‘ICPN21-03、‘隴椒5號為中抗品種，‘紅椒王，‘B16142、‘龍椒951、‘野生椒、‘B16166、‘ICPN21-08為感病品種（圖4和表1）。這說明，果實接種法可用于辣椒品種對疫霉的抗性劃分。

果實接種法選取辣椒果作為鑒定對象具有一致性。辣椒果實作為試驗材料，病斑雖有分級，但絕大部分位于一個抗病調(diào)查標準，總體表現(xiàn)比較均一。說明辣椒果實作為抗病鑒定材料表現(xiàn)穩(wěn)定（圖4）。

3 結論與討論

3.1 3種活體接種方法的比較

本試驗摸索了3種活體鑒定方法，發(fā)現(xiàn)這3種接種方法均可使辣椒在幾天內(nèi)發(fā)病，并可區(qū)分辣椒品種對疫霉的反應，3種方法各有優(yōu)缺點，可以根據(jù)需要選擇適宜的接種方法。

以辣椒葉片為接種材料，接種葉片在幾天內(nèi)發(fā)病，并很快蔓延至整株，可快速鑒定對疫霉的抗性。葉接種法操作簡單，能夠同時檢測大量品種，但與葉部噴霧接種法[45]一樣，需長時間保濕來增加侵染效率。要求空氣濕度達到90%左右，空氣濕度不一致會導致發(fā)病情況不一致，空氣濕度保持均勻一致時，同批供試材料的抗性結果基本一致。即空氣濕度的強度和均一性是制約葉片侵染法的主要因素。由于不同品種辣椒的葉片面積相差較大，葉接種法在接種量方面存在差異，根據(jù)病斑面積不能進行病情分級。

莖接種法同樣操作簡單，接種后發(fā)病快，可以同時檢查大量品種。莖接種法可通過接種后病斑長度變化來反映病斑的擴展速度，適宜對抗性量化。根據(jù)病斑擴展的速度即可區(qū)別品種間的抗性差異。因莖接種部位的上部莖葉有受侵染后整體脫落形成斷莖的現(xiàn)象，部分接種后植株的病斑長度不能測量，無法判斷受害等級。且莖接種法對空氣濕度要求高，空氣濕度同樣制約侵染效率和發(fā)病程度。空氣濕度保持均勻一致時，同批供試材料的抗性結果基本一致。莖接種法與葉接種法[4，6]同樣因缺少病原菌與根際微生物間的相互作用而與田間侵染不符。

莖基部接種法更接近田間病害的發(fā)生過程，最能反映品種的真實抗性，不過，該法需要培養(yǎng)孢子囊，當鑒定品種數(shù)量多時，需要菌量大，工作量大。接菌量少時，發(fā)病耗時長，侵染效率低。研究者嘗試采用在土壤中包埋菌塊來替代澆灌菌液的方法，解決灌根法[78]中對菌量的需求，但沒有達到預期目的。

3.2 辣椒果實接種法的優(yōu)劣

果實接種法的優(yōu)勢在于接種后發(fā)病時間短，傷口的存在為侵染提供了便利，縮短了發(fā)病時間。接種后3 d，接種部位發(fā)病，5 d感病品種大部分腐爛變軟。果實接種法采用菌餅接種，這種方式對病菌的需求量小，一個培養(yǎng)皿內(nèi)的菌絲可以接種40個果左右，解決了大量培養(yǎng)菌耗時耗力的問題。果實接種法可以應用于各種辣椒品種，基本不受果形限制。

果實接種法可以根據(jù)病斑擴展的速度區(qū)別品種間的抗性差異，對抗性進行量化，能有效區(qū)分抗感疫病品種。

果實接種法基于同一辣椒品種的果實對疫病抗性的一致性，可每個品種選取3個果實作為試材進行初步篩選，經(jīng)初步篩選后的材料再采取辣椒果實鑒定方法或其他鑒定方法進一步大量接種鑒定。采用果實接種法進行初步篩選，快速簡便，操作簡單，可同時篩選大量品種，有利于抗疫病品種的快速篩選。

果實接種法以離體果實為研究對象，能夠在短時間內(nèi)檢測多個品種，對辣椒植株無任何損傷，不影響植株的生長，辣椒原有植株可用于其他試驗或取種。即使是感病品種，也能在進行抗疫病鑒定的同時保存品種資源，在對種質(zhì)資源稀少的品種進行抗疫病鑒定方面有優(yōu)勢。另外，果實接種法鑒定在辣椒青果期的任何階段都可以進行，試驗周期短，試驗時間充足。

果實接種法的缺點在于以離體的果實作為鑒定材料，不存在系統(tǒng)抗性反應。另外，濾紙的濕度要保持一致，避免濕度過大導致果實過度腐爛，影響病級判定。對于果實太小的品種，如圓球形的果實，也存在病級判定的問題。

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（責任編輯：楊明麗）