TLC—生物自顯影檢測26種植物中的抗細(xì)菌和抗氧化活性物質(zhì)

單體江 張偉豪 王松

摘要 我國華南地區(qū)植物資源豐富，為快速篩選和檢測具有抗菌和抗氧化活性的植物資源，本研究采用甲醇冷浸提取法制備植物提取物，并采用TLC-生物自顯影法快速檢測其抗細(xì)菌和抗氧化活性。活性測定的結(jié)果表明，豺皮樟和桂木的抗細(xì)菌活性最強(qiáng)，對所有供試細(xì)菌均表現(xiàn)出抑制活性，且抑菌斑的最大直徑均大于10 mm。紅果仔、錫葉藤和山油柑也對所有供試細(xì)菌表現(xiàn)出抑制活性，但其活性弱于豺皮樟和桂木。糞箕篤、海金沙和小蠟未表現(xiàn)出任何抗細(xì)菌活性，其他供試植物對部分供試細(xì)菌表現(xiàn)出抑制活性。白花酸藤子、海南杜英、黃牛木、山油柑和基及樹表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，抗氧化斑的Rf值范圍為0.0～1.0，說明具有較多的活性化合物。TLC-生物自顯影法能夠快速、有效地篩選和檢測具有抗細(xì)菌和抗氧化活性的植物提取物，本研究結(jié)果為植物資源的開發(fā)和利用提供重要的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 TLC-生物自顯影法； 抗細(xì)菌活性； 抗氧化活性

中圖分類號： S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017308

Abstract Plant resources are wealthy in South China. To rapidly screen and detect the antibacterial and antioxidant activities in plants， methanol cold leaching extraction method was used for the preparation of plant extracts， and the antibacterial and antioxidant activities were detected by TLC-bioautoradiography assay. Litsea rotundifolia andArtocarpus nitidus displayed the strongest antibacterial activities against all the tested bacteria and the maximum diameter of inhibition zone was more than 10 mm.Eugenia uniflora，Tetracera asiatica andAcronychia pedunculata also showed inhibitory activities against all the tested bacteria， but their inhibitory activities were weaker than those ofLitsea rotundifolia andArtocarpus nitidus.Stephania longa，Lygodium japonicum andLigustrum sinensedid not show any antibacterial activity to the tested bacteria. The others exhibited inhibitory activities against parts of the tested bacteria.Embelia ribes，Elaeocarpus hainanensis，Cratoxylum cochinchinense，A. pedunculata andCarmona microphyllashowed better antioxidant activities than the others， and the range ofRf value was 0.0-1.0， which indicated that there were more active compounds in these plants. The results showed that TLC-bioautoradiography assay could screen and detect the antibacterial and antioxidant activities of plant extracts quickly and effectively. This study provides important theoretical basis for the development and utilization of plant resources.

Key words TLC-bio-autoradiography assay； antimicrobial activity； antioxidant activity

自然界中植物資源豐富，從植物中篩選提取生物活性物質(zhì)一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)[1]。植物次生代謝產(chǎn)物是由植物次生代謝產(chǎn)生的許多結(jié)構(gòu)不同的小分子有機(jī)化合物，其種類繁多，結(jié)構(gòu)迥異，具有抗菌、抗氧化和抗病毒等多種生物活性，目前已闡明的植物活性次生代謝產(chǎn)物包括萜類、黃酮類、生物堿類、植物肽類、揮發(fā)油類、木脂素、鞣質(zhì)、香豆素、皂苷等[2-7]。植物中的化學(xué)成分有數(shù)十種甚至數(shù)百種，但其中具有抗菌或抗氧化活性的化學(xué)成分可能只有一種或幾種，生物活性組分的快速檢測和篩選是天然活性物質(zhì)研究中的關(guān)鍵一步，因此建立快速、準(zhǔn)確的活性物質(zhì)篩選方法對活性物質(zhì)的分離以及新化合物的發(fā)現(xiàn)具有重要作用[8]。

薄層層析（TLC）-生物自顯影法具有簡單快速、樣品成分在薄層板上得以保留并能直觀顯示成分的生物活性的特點(diǎn)[9]。相較于瓊脂平板擴(kuò)散法，供試樣品用量更少，而與比濁法、梯度稀釋法等比較，操作更為簡單，條件要求不高，且快速，易觀察，對提取物中化合物的數(shù)目和極性也有初步的了解，目前已廣泛用于植物和微生物中活性物質(zhì)的篩選和檢測[10-12]。本研究選取華南地區(qū)常見的26種植物，采用冷浸提取法提取其次生代謝產(chǎn)物，并通過TLC-生物自顯影法快速檢測其抗菌和抗氧化活性，以期篩選出具有生物活性的植物提取物，為天然活性產(chǎn)物以及植物資源的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

供試植物詳見表1，共計(jì)26種，分屬于24科。所有供試植物均于2014年4月25至27日采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園和廣州市火爐山森林公園。 采集標(biāo)本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院鄭明軒老師鑒定。

1.2 供試細(xì)菌

供試細(xì)菌有6種，分別為桉樹青枯病菌Ralstonia solanacearum （G-）、黃瓜角斑病菌Pseudomonas lachrymans （G-）、根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens （G-）、大腸桿菌Escherichia coli （G-）、番茄瘡痂病菌Xanthomonas vesicatoria （G-）和枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis （G+）。以上菌株均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院森林保護(hù)教研室提供。

1.3 儀器和試劑

超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；三用紫外儀，上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會(huì)社；電子秤，美國雙杰電子科技有限公司；三洋高壓滅菌鍋，松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；移液器，Eppendorf生命科技公司；海爾醫(yī)用冷藏箱，海爾生物醫(yī)療有限公司。

甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和無水乙醇均為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；MTT，美國Sigma-Aldrich集團(tuán)公司；DPPH，美國Sigma-Aldrich集團(tuán)公司；硫酸鏈霉素，美國Sigma-Aldrich集團(tuán)公司；LB培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；薄層層析硅膠，青島海洋化工廠分廠。

1.4 植物次生代謝產(chǎn)物的制備

采用甲醇冷浸提取法制備植物次生代謝產(chǎn)物。將采集到的植物材料剪碎后分別裝入三角瓶，加入甲醇冷浸提取3次，每次7 d。濃縮提取液，水混懸后用乙酸乙酯萃取3次，濃縮乙酸乙酯萃取液即得到各植物的乙酸乙酯層提取物，將其轉(zhuǎn)入西林瓶中，4℃冷藏備用。

1.5 抗細(xì)菌活性的測定

采用TLC-MTT-生物自顯影法測定各植物粗提物對供試細(xì)菌的抑制活性[11-12]。先將植物提取物用乙酸乙酯溶解，而后用直徑為0.5 mm的毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為5 μL。用二氯甲烷和甲醇作為展開劑進(jìn)行薄層層析。陽性對照為0.2 mg/mL的硫酸鏈霉素，點(diǎn)樣量為5 μL。向滅菌的LB半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為0.5%）中加入一定量供試菌液（45 mL LB培養(yǎng)基+5 mL供試菌液），將其濃度調(diào)至約108 cfu/mL，振蕩、均勻。將制備好的菌懸液均勻噴灑到硅膠板上；待培養(yǎng)基在硅膠板上冷卻后，將硅膠板置于培養(yǎng)皿中于4℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的擴(kuò)散；而后將培養(yǎng)皿置于28℃下保濕培養(yǎng)，12 h后取出硅膠板，在其上均勻噴灑噻唑藍(lán)（MTT），約10 min后即可觀察試驗(yàn)結(jié)果。硅膠板上有抗菌活性成分處，供試細(xì)菌由于受到抑菌成分的抑制而出現(xiàn)抑菌斑；無抗菌活性成分處，供試菌正常生長，通過MTT顯色后出現(xiàn)背景色。通過抑菌斑的遷移率（即Rf值）來初步評價(jià)樣品中抗菌化合物的數(shù)量和極性，根據(jù)抑菌斑直徑初步評價(jià)化合物的活性和含量。Rf值計(jì)算公式如下：

Rf值=抑菌斑與點(diǎn)樣處之間的距離展開劑前沿與點(diǎn)樣處之間的距離

在實(shí)際試驗(yàn)中，由于抑菌斑并不規(guī)則，很難確定抑菌斑的中心，因此在本論文中采用抑菌斑前后兩端的Rf值來表示抑菌斑的范圍，以抑菌斑左右兩側(cè)延伸的最大直徑來表示抑菌斑的直徑。采用正相硅膠在展開劑相同的條件下，Rf值與化合物的極性成反比，即Rf值越大，化合物的極性越小，Rf值越小，化合物的極性越大。

1.6 抗氧化活性的測定

采用TLC-DPPH-生物自顯影法測定各植物提取物的抗氧化活性[13]。薄層層析的方法同1.5，待溶劑揮發(fā)后，噴施0.1% 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 無水乙醇溶液顯色，具有抗氧化活性的區(qū)域呈熒光黃色，不具有抗氧化活性的區(qū)域?yàn)樵Ｍㄟ^抗氧化活性化合物的遷移率（即Rf值）和抗氧化斑的最大直徑初步評價(jià)抗氧化化合物的極性和含量。Rf的計(jì)算同1.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物提取物對供試細(xì)菌的抑制活性

采用TLC-MTT-生物自顯影法測定了不同植物提取物對供試細(xì)菌的抑制活性，其結(jié)果如表2和圖1b所示。從表中可以明顯看出，除糞箕篤、海金沙和小蠟3種植物外，其余23種植物提取物均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，但對不同供試細(xì)菌的抑菌活性不同。桂木、紅果仔、錫葉藤、山油柑和豺皮樟對6種供試細(xì)菌均表現(xiàn)出抑制活性，其中抑菌活性最好的為豺皮樟，抑菌斑的最大直徑均大于10 mm，Rf值的范圍集中在0.00～0.60之間，說明具有抑菌活性的化合物極性中等偏大；其次是桂木， Rf值為0.00～0.13的范圍內(nèi)時(shí)抑菌圈的最大直徑大于10 mm，說明與豺皮樟相比，桂木中具有抑菌活性的化合物極性偏大，Rf值為0.17～0.38時(shí)桂木粗提物表現(xiàn)出微弱的抑制活性，抑菌斑的最大直徑在0～5 mm之間。白花酸藤子、海南杜英、破布葉、毒根斑鳩菊、喜樹、白蘭、美麗異木棉、異葉南洋杉、黃梁木、黃牛木和基及樹粗提物對5種供試細(xì)菌表現(xiàn)出抑制活性，其中毒根斑鳩菊粗提物除對桉樹青枯病菌無抑制活性外，對其他供試細(xì)菌的最大抑菌斑直徑均大于10 mm；其次是喜樹粗提物，雖然抑菌斑直徑在5～10 mm，但是活性化合物的Rf值范圍為0.00～0.68，說明具有活性的化合物更多。白蘭中活性化合物的極性中等偏小，Rf值為0.18～0.98，但大多集中在0.35～0.80，抑菌斑的最大直徑差別較大，其中對大腸桿菌和黃瓜角斑病菌的最大抑菌斑直徑大于10 mm，與毒根斑鳩菊和喜樹一樣，白蘭提取物對桉樹青枯病菌也未表現(xiàn)出抑制活性。貓尾木、鐵刀木和海芋粗提物對4種供試細(xì)菌表現(xiàn)出抑制活性；鯽魚膽和海桐粗提物僅對3種供試細(xì)菌表現(xiàn)出抑制活性；黃花風(fēng)鈴木粗提物僅對2種供試細(xì)菌表現(xiàn)出抑制活性；雖然水茄粗提物僅對大腸桿菌表現(xiàn)出抑制活性，但抑制活性較強(qiáng)，在Rf值0.00～0.25，抑菌斑直徑大于10 mm。綜上所述，豺皮樟和桂木提取物的抑菌活性最強(qiáng)，且具有廣譜性，可作為候選的植物資源進(jìn)一步分析和鑒定其抗菌活性化合物。多數(shù)植物提取物對不同供試細(xì)菌均具有一定的抑制活性，可根據(jù)其供試細(xì)菌選擇相應(yīng)的植物提取物。不同植物提取物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑制活性無明顯差異。

2.2 不同植物提取物的抗氧化活性

采用TLC-DPPH-自顯影法測定了26種植物提取物的抗氧化活性，其結(jié)果如表3和圖1c所示。所有供試植物均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，但抗氧化斑的最大直徑和Rf值差別較大。從表3可以看出，鯽魚膽提取物在Rf值0.00～0.18的范圍內(nèi)，抗氧化斑的最大直徑大于10 mm，在所有供試植物提取物中表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性，具有抗氧化活性的化合物極性偏大；如果Rf值在0.92～1.00的范圍內(nèi)，抗氧化斑的最大直徑在5～10 mm，則表明具有抗氧化活性的化合物極性偏小，本試驗(yàn)中白花酸藤子、黃花風(fēng)鈴木、貓尾木、鐵刀木、海南杜英、喜樹、美麗異木棉、小蠟、水茄、黃牛木、山油柑、豺皮樟和基及樹提取物的最大抗氧化斑直徑在5～10 mm之間，其他供試植物的抗氧化斑直徑均小于5 mm。另外，從Rf值的范圍來看，白花酸藤子、海南杜英、黃牛木、山油柑和基及樹中具有抗氧化活性化合物的Rf值范圍較大，幾乎在0.00～1.00的范圍內(nèi)均具有抗氧化活性。綜上所述，雖然鯽魚膽的抗氧化斑直徑最大，但化合物的Rf值范圍窄，說明具有抗氧化活性的化合物少，同時(shí)具有抗氧化活性的化合物極性太大或太小，不利于化合物的分離和鑒定，因此更適合從白花酸藤子、海南杜英、黃牛木、山油柑和基及樹中分離純化具有抗氧化活性的化合物。

3 討論

本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，多數(shù)植物粗提物表現(xiàn)出較好的抑菌活性和抗氧化活性，其中不乏優(yōu)良的活性成分待選者。植物源農(nóng)藥具有環(huán)境友好、對非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性、作用方式特異、促進(jìn)作物生長并提高抗病性、種類多、開發(fā)途徑多等特點(diǎn)[14]。豺皮樟、桂木、紅果仔、錫葉藤和山油柑的抗菌活性以及白花酸藤子、海南杜英、黃牛木、山油柑和基及樹的抗氧化活性均具有較好的開發(fā)和應(yīng)用前景。陳佳齡等對紅果仔葉揮發(fā)物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其富含保健性揮發(fā)成分[15]；紅果仔果實(shí)和葉片中的多酚黃酮具有較好的抗氧化活性[16-17]，同時(shí)紅果仔提取物對枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌具有較強(qiáng)的抑制活性[18]，本試驗(yàn)中紅果仔粗提物對6種供試細(xì)菌表現(xiàn)出抑制活性，說明紅果仔粗提物中含有較多的抗細(xì)菌成分。山油柑莖皮和木質(zhì)部揮發(fā)物具有細(xì)胞毒活性[19]，同時(shí)對金黃色葡萄球菌、腸沙門氏菌和表皮葡萄球菌也表現(xiàn)出抑制活性[19-20]；山油柑的甲醇提取物具有較好的抗氧化活性[21]，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。綜上所述，本研究中篩選出的部分植物確實(shí)具有抗菌、抗氧化以及細(xì)胞毒等多種生物活性，但本研究側(cè)重于對農(nóng)業(yè)和林業(yè)病原細(xì)菌的研究。此外，嚴(yán)小紅對豺皮樟提取物和揮發(fā)油進(jìn)行成分分析，錫葉藤和豺皮樟化學(xué)成分已有報(bào)道，但均未見其生物活性相關(guān)報(bào)道[22-24]，而在本次試驗(yàn)中兩種植物都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗菌與抗氧化活性，值得深入研究。 近幾年通過薄層層析（TLC）聯(lián)合使用MTT、DPPH、TTC、Cu2+-新亞銅靈試劑等藥品，可直接顯示相應(yīng)的生物活性[25-27]，本研究的結(jié)果表明，TLC-生物自顯影法是一種快速有效的篩選活性提取物的方法，可根據(jù)斑點(diǎn)的Rf值來初步評價(jià)樣品中化合物的數(shù)量和極性，根據(jù)斑點(diǎn)的大小來初步評價(jià)化合物的活性，簡單直觀地顯示樣品中生物活性成分。本文只對乙酸乙酯層粗提物進(jìn)行了活性篩選和檢測，對于乙酸乙酯提取后的剩余部分是否具有活性還有待于進(jìn)一步研究。此外，對篩選出的候選植物可進(jìn)一步分離和鑒定活性成分，以闡明具有生物活性的化合物的結(jié)構(gòu)，從而為天然活性藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)，為植物資源的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] LEWIS K， AUSUBEL F M. Prospects for plant-derived antibacterials [J]. Nature Biotechnology， 2006， 24（12）： 1504-1507.

[2] 趙寶娟，王平保，徐為人，等.植物源抗菌活性成分的研究進(jìn)展[J].中草藥，2003，34（10）：17-21.

[3] BEDNAREK P， OSBOURN A. Plant-microbe interactions： chemical diversity in plant defense [J].Science，2009，324（5928）：746-748.

[4] 劉文靜，劉東波，張志旭，等.藥食兼用植物抑菌和抗炎作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2016，47（19）：3535-3542.

[5] 李文茹，施慶珊，謝小保，等.植物精油化學(xué)成分及其抗菌活性的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2016，43（6）：1339-1344.

[6] 覃瀚儀，李魏，戴良英.植物代謝產(chǎn)物在抗病反應(yīng)中的功能研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（18）：256-259.

[7] 李彥，周曉東，樓浙輝，等.植物次生代謝產(chǎn)物及影響其積累的因素研究綜述[J].江西林業(yè)科技，2012（3）：54-60.

[8] 吳新安，花日茂，岳永德，等.植物源抗菌、殺菌活性物質(zhì)研究進(jìn)展（綜述）[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，29（3）：245-249.

[9] 曲建博，婁紅祥，范培紅.TLC生物自顯影技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用[J].中草藥，2005，36（1）：132-137.

[10]SHAN Tijiang，SUN Weibo，LOU Jingfeng，et al.Antibacterial activity of the endophytic fungi from medicinal herb，Macleaya cordata [J].African Journal of Biotechnology，2012，11（19）：4354-4359.

[11]伍慧雄，秦楷，張偉豪，等.長葉竹柏次生代謝產(chǎn)物及其抗細(xì)菌活性[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，47（11）：1867-1874.

[12]張偉豪，劉易，王小晴，等.糖膠樹花次生代謝產(chǎn)物及其抗細(xì)菌活性[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（3）：104-108.

[13]郭金鳳，張俊妹，張芳，等.TLC-生物自顯影法篩選榆葉合葉子的抗氧化活性[J].中國民族民間醫(yī)藥，2013，22（24）：9-10.

[14]張興，馬志卿，馮俊濤，等.植物源農(nóng)藥研究進(jìn)展[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2015，31（5）：685-698.

[15]陳佳齡，郭微，彭維，等.SPME-GC-MS分析桃金娘科6種植物的葉片揮發(fā)性成分[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2013，21（2）：189-192.

[16]MARTINEZ-CORREA H A，MAGALHES P M，QUEIROGA C L，et al. Extracts from pitanga （Eugenia uniflora L.） leaves： Influence of extraction process on antioxidant properties and yield of phenolic compounds [J]. Journal of Supercritical Fluids，2011，55（3）：998-1006.

[17]MASSARIOLI A.Antioxidant activity of different pitanga （Eugenia uniflora L.） fruit fractions [J].Journal of Food Agriculture & Environment，2013，11（1）：288-293.

[18]OLIVEIRA M D， ANDRADE C A， SANTOSMAGALHES N S， et al. Purification of a lectin fromEugenia uniflora L. seeds and its potential antibacterial activity [J].Letters in Applied Microbiology，2008，46（3）：371-376.

[19]王軍，蔡彩虹，陳亮亮，等.海南山油柑揮發(fā)性成分及其生物活性[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（12）：26-30.

[20]LESUEUR D，DE ROCCA SERRA D，BIGHELLI A，et al.Composition and antimicrobial activity of the essential oil ofAcronychia pedunculata （L.） Miq. from Vietnam [J].Natural Product Research，2008，22（5）：393-398.

[21]GIREESHA J，RAJU N S.Phytochemical analysis， antibacterial and antioxidant potential ofAcronychia pedunculata （L.） Miq [J].Annals of Phytomedicine，2016，5（2）：147-151.

[22]周興棟，程淼，余紹福，等.錫葉藤的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2015，46（2）：185-188.

[23]YAN Xiaohong， WEI Xiaoyi， XIE Haihui， et al. Aporphine alkaloids ofLitsea rotundifolia andL. rotundifolia var.oblongifolia [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2000， 8（4）： 324-328.

[24]嚴(yán)小紅，張鳳仙，魏孝義，等.豺皮樟根部揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].中藥材，2000，23（6）：331-332.

[25]韓笑，孫旭梅，王璐文，等.7種木腐菌生物活性檢測[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（28）：141-145.

[26]古扎力努爾·艾爾肯，王健，蘭怡，等.兩色金雞菊花提取物的抗氧化活性測定及TLC-Bio分析抗氧化活性成分[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，39（7）：858-861.

[27]王曉飛，李輝，劉銘佩，等.沙棘不同組織部位的抗氧化活性研究[J].中成藥，2016，38（2）：437-440.

（責(zé)任編輯：田 喆）