陜西楊凌番茄褪綠病毒的分子檢測

王志榮 李曉東 朱玉 黃澤軍 高建昌 國艷梅 杜永臣 王孝宣

摘要 近年來在陜西番茄生產區出現了一種新病害，病株表現為葉片褪綠，葉脈顏色變深及葉片增厚，果實變小發白，嚴重影響番茄產量及經濟效益，2016年發病極為嚴重，部分產區甚至絕收。該病疑似由番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）引起。利用ToCV特異引物對感病番茄樣品進行RT-PCR檢測，結果從所采集的4份病樣中均檢測到ToCV預期大小的特異片段。對ToCV外殼蛋白CP基因和類熱激蛋白HSP70h基因進行克隆與序列分析，ToCV-YL1 CP基因774個核苷酸序列與已報道的ToCV CP基因有較高的一致性，與山東青島和山西晉中分離物同源性為100%。ToCV-YL1 HSP70h基因1 665個核苷酸序列與已報道的ToCV HSP70h基因有較高的同源性，與中國、韓國、日本、美國、希臘分離物同源性達到99%以上。研究表明ToCV已傳播至陜西地區。

關鍵詞 番茄； 番茄褪綠病毒病； CP基因； HSP70h基因

中圖分類號： S 436.41

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017240

Abstract In recent years， a new disease on tomato has occurred in tomato production area of Shaanxi Province. The diseased tomato plants showed chlorotic leaves， dark greening veins and leaf thickening occurred in the diseased tomato plants， and the fruits became partial white and small， which seriously affected the yield and economic benefits. The disease is extremely serious， leading to total yield loss in part of the producing areas in 2016. The symptom of infected tomatoes is similar to Tomato chlorosis virus （ToCV）. The expected DNA fragments were amplified from all 4 infected samples with specific markers of ToCV by RT-PCR. The coat protein gene （CP） and heat shock protein 70 （HSP70h） gene of ToCV were cloned and analyzed， respectively. The nucleotide sequence of the CP gene of ToCV-YL1 was the same as those of the previously reported ToCV isolates in Qingdao and Jinzhong. The nucleotide sequence of the HSP70h gene of ToCV-YL1 shared the highest identity （up to 99%） with those of the ToCV isolates from China， South Korea， Japan， USA and Greece. These results confirmed that ToCV had spread to Shaanxi.

Key words tomato； Tomato chlorosis virus； CP； HSP70h

番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）屬于長線形病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinivirus。ToCV基因組含有兩條正義單鏈RNA，是一種RNA病毒，其中RNA1有8 594個核苷酸，RNA2有8 242個核苷酸。ToCV是韌皮部病毒不能通過機械摩擦接種傳播[12]。在自然條件下，ToCV只能依靠媒介昆蟲煙粉虱傳播[3]，B型煙粉虱Bemisia tabaci biotype B、Q型煙粉虱B.tabaci biotype Q、A型煙粉虱B.tabaci biotype A、溫室白粉虱Trialeurodes vaporariorum、銀葉粉虱B.argentifolii和紋翅粉虱T.abutilonea等介體均可傳播ToCV[4]，該病毒是唯一能通過4種分屬于兩個屬的粉虱傳播的病毒[56]。ToCV寄主范圍廣泛，可以侵染茄科Solanaceae、菊科Compositae、藜科Chenopodiaceae、莧科Amaranthaceae、番杏科Aizoaceae、夾竹桃科Apocynaceae及白花丹科Plumbaginaceae等7科25種植物。其中，茄科寄主數最多，如番茄Solanum lycopersicum、辣椒Capsicum annuum[78]、馬鈴薯Solanum tuberosum[4]、普通煙Nicotiana tabacum、本生煙N. benthamiana等多種煙草[910]。

番茄褪綠病毒病最早于1989年在美國佛羅里達州溫室栽培番茄上出現，1998年在美國佛羅里達州該病原首次被鑒定為番茄褪綠病毒ToCV[1]。該病毒現已蔓延至世界各地，可危害多種作物[4，8，1112]，在北美洲、南美洲、歐洲、非洲和亞洲[1317]均有報道。我國最早于2004年在臺灣地區發現ToCV[14]，2013年后在北京、江蘇、山東、河北、天津、河南、遼寧、廣東等地區陸續有關于ToCV的報道[1823]。2016年在陜西楊凌番茄主產區發現番茄疑似感染ToCV，感病面積較大，表現為番茄整株褪綠黃化，果實變小發白，嚴重影響番茄生長并造成很大經濟損失，部分產區絕收。本研究對采集的感病番茄樣品進行了分子檢測與鑒定，并對ToCV外殼蛋白CP基因和類熱激蛋白HSP70h基因進行克隆與序列分析，以探討引起該病害的原因，并對其進行有效防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2016年11月在陜西省楊凌番茄生產區的感病區采集4份感病番茄材料葉片，編號為ToCV-YL1～ToCV-YL4，同時采集該生產區非感病區健康番茄葉片作為對照。

1.1.2 生化試劑和菌株、載體

RNA提取試劑盒EasyPure Plant RNA Kit、反轉錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、FastPfu DNA聚合酶、凝膠回收試劑盒EasyPureQuick Gel Extraction Kit、克隆載體pEASY-Blunt Zero Clonging Kit、Trans1-T1感受態細胞均由北京全式金生物技術有限公司提供。分子量標準DNA Marker IV由天根生化科技有限公司提供，2×DNA Taq PCR Mix由北京依聯軒科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄葉片總RNA的提取及檢測

使用RNA提取試劑盒提取番茄葉片總RNA。取番茄編號為ToCV-YL1～ToCV-YL4和健康番茄樣品的葉片0.1 g，依照試劑盒提取說明步驟提取總RNA，最終將RNA溶解于40.0 μL RNAse free-water中。保存于-80℃用于后續試驗。以番茄葉片總RNA作為模板，使用反轉錄試劑盒反轉錄RNA合成cDNA。反應體系20.0 μL及具體試驗步驟如下：RNA 5.0 μL，0.5 μg/μL Anchored Oligo（dT）18 Primer 1.0 μL，RNAse free-water 2.0 μL；65℃變性5 min，迅速冰浴2 min。再加2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1.0 μL，gDNA Remover 1.0 μL，42℃孵育30 min，80℃加熱5 min失活TransScriptRT與gDNA Remover。利用RT-PCR技術對番茄褪綠病毒進行檢測，以cDNA為模板利用引物ToCV-F/R進行RT-PCR擴增。反應體系為：cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.2 μL，Mix 5.0 μL，滅菌水 3.6 μL，總體積為10.0 μL。PCR反應程序：預變性94℃ 4 min；變性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，32個循環；終延伸72℃ 5 min。PCR產物經3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 ToCV特異引物設計

根據NCBI網站上已公布的北京分離物ToCV基因組序列設計了4對特異引物（表1）。ToCV-F/R是根據ToCV-BJ RNA1（登錄號：KC887998）序列設計的特異引物，CP-1-F/R、HSP-2-F/R、HSP-3-F/R 是根據ToCV-BJ RNA2（登錄號：KC887999）序列設計的特異引物。CP-1-F/R能擴增CP基因的774 bp序列，HSP-2-F/R、HSP-3-F/R擴增序列進行拼接得到1 665 bp的HSP70h基因序列。

1.2.3 ToCV的CP基因及HSP70h基因擴增、序列克隆及測序

RT-PCR擴增體系50.0 μL，包括cDNA 2.0 μL，2×TransStart FastPfu Mix 25.0 μL，上下游引物各1.0 μL，滅菌水21.0 μL。PCR反應程序：預變性95℃ 3 min；變性95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40個循環；終延伸72℃ 5 min。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠回收試劑盒回收目的譜帶，回收產物克隆到Blunt Zero載體上。轉化到大腸桿菌Trans1-T1，經驗證每對引物均得到5個陽性克隆后，再分別選取3個陽性克隆送北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

1.2.4 序列分析

將得到的CP基因序列和HSP70h基因序列在NCBI網站中進行分析比對，根據比對結果，再選取NCBI上已發表的ToCV分離物的CP基因完整序列51份和HSP70h基因完整序列42份（表2～3）。利用DNAStar中的DNAMAN軟件對選定的序列進行同源性比對，利用Mega6.0軟件的Clustal W法進行多序列比對分析以及鄰接法（neighbor-joining， NJ）構建系統進化樹，系統進化樹中各分支置信度（bootstrap）進行1 000次重復分析。

2 結果與分析

2.1 ToCV RT-PCR 檢測結果

利用ToCV特異標記ToCV-F/R進行RT-PCR分析，4份感病番茄材料均能檢測到與預期大小一致的239 bp特異片段，而健康番茄樣品中未檢測到目的片段（圖1a），結果表明陜西楊凌出現的新病害為番茄褪綠病毒病。

2.2 ToCV CP基因序列分析

利用ToCV CP基因的特異引物CP-1-F/R進行RT-PCR分析，從感病材料中擴增出839 bp片段，利用NCBI網站中BLAST功能對所得分離物的擴增序列進行比對，擴增產物包括完整CP基因（774個核苷酸），與預期結果相符，初步證明陜西楊凌番茄新病害是由番茄褪綠病毒的危害所致。CP基因的3個陽性克隆測序結果一致。

將ToCV-YL1 CP基因全長774個核苷酸（GenBank登錄號：MF346383）與在NCBI上收集的來自亞洲、歐洲、北美洲、南美洲的9個國家的51份ToCV CP基因序列進行同源性分析及進化樹構建。結果表明ToCV-YL1 CP基因序列與山東青島ToCV-SDQD（KT809400）和山西晉中ToCV-SXJZ（KX853540）序列同源性達到100%，與國內其他地區及日本、韓國、美國地區的同源性在99%以上，而與希臘、巴西、以色列、西班牙等地樣品基因序列同源性在97%～99%。這些結果表明，ToCV CP基因序列在不同地區存在一定差異，ToCV-YL1 CP基因與國內其他地區及亞洲地區CP基因具有較高同源性，相比之下，ToCV-YL1 CP基因與歐洲地區分離物CP基因同源性較低（表2）。

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（責任編輯：田 喆）