肉桂醛對RSV感染宿主細胞凋亡的影響

代立娟 劉 蕾 韓有文 李紹民 徐偉麗 馮 瀾 朱 有 李春媚

(佳木斯大學附屬第一醫院感染病科，黑龍江 佳木斯 154002)

呼吸道合胞病毒(RSV)感染后可引起宿主細胞凋亡。細胞凋亡不是被動過程，而是涉及一系列基因激活、表達以及調控過程，并且受很多因素干擾，產生不同的轉歸〔1，2〕。這個過程中凋亡不但與細胞的分化、增殖、免疫調控等生理過程有關，而且與病毒的感染量、病毒毒力以及感染后干預措施等有密切的聯系。目前對于RSV治療以支持和對癥療法為主，防控缺少特異的藥物和疫苗。肉桂醛是肉桂皮精油的主要成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用，且毒副作用小。先期研究已證實肉桂醛有抗RSV作用，但具體機制尚需要進一步研究〔3〕。本文以新近的研究為基礎，對RSV誘導宿主細胞凋亡的特征加以分析。

1 材料與方法

1.1材料 Hela細胞株，RSV株由佳木斯大學基礎醫學院病生教研室保存；肉桂醛購于美國sigma公司、1640培養液Invitrogen公司，四季青牌胎牛血清(FCS)；異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗兔IgG抗體購于美國Santa公司；Buffer緩沖液、胰酶購自博士德生物，美國BD公司流式細胞儀。

1.2細胞培養 復蘇Hela細胞，接種在10%的1 640培養液的培養瓶中，放置于37℃、5%CO2孵育箱中1～2 d更換細胞培養液，培養瓶中細胞生長約80%以上時，胰酶消化進行傳代，直至實驗所需細胞量。

1.3病毒收集接種病毒毒力測定 Hela細胞培養成70%后，接種RSV液，繼續培養當病變達到75%時經過三凍三融收集放低溫冰箱保存備用。

1.4肉桂醛配制 用2%細胞維持液將肉桂醛進行不同濃度低(0.078 1 mg/ml)、中濃度(0.156 3 mg/ml)和高濃度(0.312 5 mg/ml)稀釋再用濾器過濾備用。

1.5接種病毒毒力測定 將Hela細胞接種于96孔板待細胞長成單層，將已經稀釋好的不同濃度的病毒液每一個濃度重復8孔，并設陰性對照、正常細胞組，置于培養箱中培養，顯微鏡觀察細胞形態，根據氯化聚乙烯(CPE)結果變化用Reed-Muench法計算CCID50。

1.6肉桂醛對Hela細胞毒性測定 將Hela細胞接種96孔板中，不同濃度的肉桂醛接種，顯微鏡觀察細胞形態學，波長490 nm酶標儀檢測并記錄吸光度數值。

1.6.1對RSV的直接滅活作用 將Hela細胞接種至六孔板中長成約70%備用，將低(0.078 1 mg/ml)、中(0.156 3 mg/ml)和高濃度(0.312 5 mg/ml)的肉桂醛與病毒液等量混勻，置37℃溫箱2 h。棄六孔板中培養液。每孔加入不同濃度混合液，設病毒對照，正常細胞對照，置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液，加入細胞維持液，觀察細胞變化，病毒對照組病變70%時檢測。

1.6.2對RSV的吸附作用 將Hela細胞接種至六孔板中長成約70%備用，將低中高濃度的肉桂醛與病毒液等量混勻，棄六孔板中培養液。每孔加入低，中，高濃度肉桂醛病毒混合液，設病毒對照，正常細胞對照，置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液，加入2%細胞維持液，觀察細胞變化，待檢測。

1.6.3對RSV的生物合成作用 將Hela細胞接種至六孔板中長成約70%備用，將200 μl病毒液加至六孔板中留正常對照組。37℃溫箱孵育2 h，棄病毒液加入不同濃度肉桂醛2～3 ml，留病毒對照正常對照組，待檢測。

1.7流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡 棄六孔板內細胞培養液，緩沖液沖洗細胞吸盡PBS；加入500 μl胰酶(不含EDTA)消化，加入2%FCS 3 ml每孔終止消化，轉移至10 ml離心管，1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入2%FCS 5 ml每管，1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入1成Buffer 3 ml每管1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入100 μl～200 μl 1×緩沖液；7-AAD 5 μl+Annexin V-FITC5 μl上樣；加入100 μl細胞液，避光15 min；上機檢測，激發波長Ex=488 nm。

2 結 果

2.1肉桂醛無毒濃度測定 在一定范圍內肉桂醛濃度降低使其對細胞毒性降低，細胞活力逐漸增強，計算得出肉桂醛的有效無毒濃度范圍為0.156 3～0.312 5 mg/ml。

2.2RSV毒力 當病毒對照組細胞病變達到75%時，電鏡下一半細胞出現形態學變化時認為CPE陽性。用Reed-Muench法計算得CCID50為106.65，本實驗中100CCID50/100 μl病毒攻擊量為104.65。

2.3流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡情況 與正常細胞對照組相比，感染RSV組的細胞凋亡百分比成倍增加，經藥物干預，給藥組的細胞凋亡百分比明顯下降，具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組Hela細胞凋亡程度比較±s)

3 討 論

RSV感染引起細胞凋亡，依據病毒的特性、增殖侵入細胞的步驟和時間點，本文用肉桂醛在這些時間點進行干預，破壞RSV增殖的酶系統。以阻斷病毒的進一步擴增，誘導Hela細胞發生功能性的細胞凋亡。

從正常組和病毒組統計對比看出RSV的致病力很強，電子顯微鏡下觀察引起細胞的大量死亡。細胞凋亡是機體主動防御應對病毒感染的一種方式，凋亡和細胞增殖都是生命的基本現象，是維持細胞數量動態平衡的措施，形態學細胞體積減小、胞質減少，終聚合成多個凋亡小體而被吞噬細胞吞入消化〔4〕。在進程中細胞的部分結構始終較完整，不損傷和累及其他細胞，也不引起組織機體的炎癥毒性反應〔5〕。病毒感染細胞后，內生的蛋白產物直接作用細胞，與凋亡有關的因子在肉桂醛作用下誘導發生凋亡起到自我保護作用。宿主細胞受到病毒攻擊后是在細胞本身發出凋亡信號作用下，機體內本能的保護性的死亡途徑被激活的一個過程，并在關聯基因調控下發生的有規律的主動的死亡過程〔6〕。這個過程可能發生不同的轉歸，本文觀察給藥組和病毒組在不同藥物濃度不同作用時間點的情況下，與病毒組相比治療組細胞凋亡率明顯下降，可以證實肉桂醛對RSV有明顯殺滅作用。當病毒下降到一定滴度的時候，病毒本身不再增殖它將不具備明顯的致病能力。這時正常細胞的增殖分化將會加快，最終將病毒清除。

RSV從發現至今人們就沒有停止對于治療藥物的研發，但由于病毒本身存在的變異和抗病毒藥物研發的緩慢，迄今能有效用于臨床而又毒副作用小的藥物屈指可數。本研究證實肉桂醛的抗RSV病毒作用〔7〕，但實用性、穩定性還有待進一步研究，希望該成果能對新的抗RSV藥物的研制有所幫助。

4 參考文獻

1Han X，Li Z，Chen H，etal.Influenza virus A /Beijing /501 /2009(H1N1) NS1 interacts with β-tubulin and induces disruption of the mi-crotubule network and apoptosis on A549 cells〔J〕.PLoS One，2012；7(11)：e48340.

2彭慧琴，朱圣禾，蔡衛民.呼吸道合胞病毒感染與細胞凋亡的研究進展〔J〕.國外醫學·病毒學分冊，2005；12(1)：131-3.

3代立娟，王 琳，馮 瀾.肉桂醛抗呼吸道合胞病毒的作用〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(6)：1309-12.

4Richetta C，Faure M.Autophagy in antiviral innate immunity〔J〕.Cell Microbiol，2013；15(3)：368-76.

5Oshansky CM，Zhang W，Moore E，etal.The host response and molecular pathogenesis associated with respiratory syncytial virus infection〔J〕.Future Microbiol，2009；4(3)：279-97.

6Xi X，Zhang X，Wang B，etal.The interplays between autophagy and apoptosis induced by enterovirus〔J〕.PLoS One，2013；8(2)：e56966.

7代立娟，韓有文，李紹民，等.肉桂醛對RSV宿主細胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(3)：1575-7.