黃腐酸對番茄幼苗適應低磷脅迫的生理調控作用

張麗麗，劉德興，史慶華，鞏彪

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黃腐酸對番茄幼苗適應低磷脅迫的生理調控作用

張麗麗，劉德興，史慶華，鞏彪

（山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室/農業部黃淮海地區園藝作物生物學與種質創新重點實驗室，泰安 271018）

【目的】磷是植物生長發育的關鍵元素之一，缺磷會嚴重影響作物的產量和質量。黃腐酸作為一種天然有機物，在促進植物生長的同時還能提高植物的抗逆能力。開展黃腐酸對番茄幼苗適應低磷脅迫生理調控作用研究,明確黃腐酸對番茄適應低磷脅迫的生理調控機制，對黃腐酸緩解番茄“遺傳學缺磷”的概念和機理做出合理解釋。【方法】采用Hogland營養液水培方式,以番茄‘金棚1號’為供試品種，待番茄幼苗長到三葉一心時移到水培盆中緩苗7 d,外源添加不同濃度（0、0.04、0.08、0.12、0.16和0.20 g·L-1）黃腐酸,研究其對低磷脅迫（10 μmol·L-1）下番茄幼苗生長、根系發育、光合作用性能、磷素吸收和分配、有機酸積累和分泌等生理過程的影響。【結果】低磷脅迫下，隨著黃腐酸施用量的增加，番茄幼苗的各項生理指標基本呈現先增后降趨勢。當黃腐酸的施用濃度為0.08 g·L-1時，顯著提高根冠比；增加葉綠素含量，提高葉片光合作用性能；提高番茄不同組織中磷素積累、分配和轉運；提高磷轉運相關基因（和）的表達，其中能促進番茄幼苗根系向環境中吸收磷酸鹽緩解低磷脅迫；能促進磷酸鹽由根系向莖葉分配從而有效緩解地上部缺磷。黃腐酸能提高根系有機酸（草酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和酒石酸）積累，降低根系中無氧呼吸產物乳酸和乙酸含量，促進質子泵基因（）的表達，促進根系泌酸，這種生理代謝變化有利于將環境中難溶性的磷轉變為可溶性的磷，并促進植物根系對磷素吸收；增強生長發育相關轉錄因子（）表達，降低葉片花青素積累。【結論】通過低磷脅迫下添加一定濃度的黃腐酸可明顯改善番茄幼苗地上部生長及根系發育，可在一定程度上緩解植物的缺磷癥狀。

番茄；黃腐酸；低磷脅迫；生理調控

0 引言

【研究意義】磷（P）是植物生長發育所必需的第二大礦質營養元素，其參與植物體內的生物大分子合成及物質和能量轉化。中國2/3以上的耕地處于缺磷狀態，成為農業發展的限制因子[1]。雖然外施磷肥能解決土壤中磷素匱乏的問題，但我國磷礦資源短缺，用于農業生產的磷肥尚需進口；且磷素在土壤中易被固定，僅處于根區表層的磷易被植物吸收利用[2]。目前我國蔬菜生產施肥量大，絕大多數蔬菜產區土壤中的磷含量已經高于蔬菜需磷水平，但可被蔬菜作物吸收利用的磷卻很有限，這時植物表現的缺磷癥狀稱為“遺傳學缺磷”[3]。這一特點使土壤磷素積累，引發農業資源污染與磷礦枯竭[4]。因此，探究蔬菜作物對磷高效吸收的生理機制對于蔬菜的安全高效生產與農業可持續發展具有重要意義。【前人研究進展】腐殖酸是由動植物遺骸經過微生物降解，輔以地球化學的一系列過程積累起來的有機物質。劉秀梅等[5]研究發現它具有提高土壤保水保肥能力、刺激植物生長等作用。韓玉國等[6]研究表明黃腐酸為腐殖酸中一個水可溶級分，其分子量低，功能團密集，具有更強的生理活性，在農業生產應用中備受關注。目前的研究表明，腐殖酸作為肥料添加劑用于保持土壤肥力的研究已取得長足進展；Canellas等[7]總結了近年來腐殖酸肥料在影響園藝作物肥料利用效率、植株生長、開花坐果、產品成熟、品質形成和抗性誘導等方面具有顯著促進效果。劉秀梅[5]、李春越等[8]在試驗中發現腐殖酸可作為土壤磷素增效劑，活化土壤中固定態磷，改善肥料物理性狀，提高其穩定性和有效性，以達到有效磷緩釋的效果。【本研究切入點】目前研究多集中于腐殖酸作為肥料添加劑增強磷素利用的方面，且涉及的腐殖酸多未經純化，成分復雜，重現性有待考證；且針對腐殖酸或黃腐酸調控蔬菜作物適應低磷脅迫的生理與分子機制的研究相對較少。【擬解決的關鍵問題】本試驗擬通過研究黃腐酸在低磷條件下對番茄幼苗生長及磷素吸收、分配與利用的調控作用，對黃腐酸緩解蔬菜作物“遺傳學缺磷”的概念和原理做出合理解釋，為黃腐酸在提高蔬菜作物磷素利用效率的應用和推廣提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2017年2—7月在農業部黃淮海設施農業工程科學觀測實驗站進行。日光溫室環境控制條件為：光周期12 h/12 h，晝/夜溫25—30℃/18—23℃，相對濕度50%—70%。

1.1 試驗設計

供試黃腐酸由山東泉林嘉有肥料有限責任公司提供。以‘金棚1號’番茄（L.）為試材，采用常規基質育苗技術進行幼苗培育，待幼苗長至三葉一心時，將長勢一致的番茄幼苗移植于裝有5 L Hoagland營養液[9]的水培盆中進行營養液栽培，每盆4株，緩苗7 d后進行試驗處理。

試驗設7個處理：對照（Control）采用Hoagland營養液培養；T0—T5采用磷含量為原Hoagland營養液1%的Hoagland減磷營養液（10 μmol·L-1）培養，模擬低磷脅迫環境，因降低NH4H2PO4所造成的氮素缺乏采用相應量的NH4NO3補齊，并向T0—T5處理的Hoagland減磷營養液中加入相應質量的黃腐酸，使處理液中黃腐酸的終濃度為0、0.04、0.08、0.12、0.16和0.20 g·L-1。試驗采用隨機區組設計，每個處理15盆，每5盆作為1個重復，共計3次重復。每3 d更換一次處理液，處理25 d后結束試驗，期間取樣進行指標分析。

1.2 測定項目與方法

植株生長：處理至25 d時，對番茄幼苗進行拍照，記錄各處理植株表型；測定莖葉鮮重和根鮮重，計算根冠比。

光合作用性能：處理至25 d時，以第2—3片完全展開的功能葉為待測試材，稱取0.5 g葉片，采用80%丙酮浸提法測定葉綠素含量[10]；采用LI-6400便攜式光合儀，于上午9:30—10:30測定凈光合速率（PN）[10]；采用FMS-2便攜式調制熒光儀測定暗適應下葉片PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）和過剩光能（EX）[11]。

磷素吸收與分配：處理至25 d時，將番茄幼苗根、莖、葉組織分離，于烘箱中烘干，研磨成粉備用。取0.1 g相應組織的粉末，采用鉬銻抗比色法測定P含量[12]；計算各器官的P積累和分配量，以及整株的P吸收量，計算公式為：P積累（器官）=P含量（器官）×干重（器官）；P吸收=P積累（根）+P積累（莖）+P積累（葉）；P分配（器官）=P積累（器官）/P吸收×100%。

有機酸含量：處理至10 d時，取2 g番茄幼苗根系組織，采用高效液相色譜法測定7種有機酸含量[12]。

根系排酸分析：本指標測定過程期間不更換處理液，各處理液起始pH均調節至6.8，處理10 d后測定處理液的pH，用以評估根系排酸能力。

基因表達分析：處理至5 d和25 d時，取0.3 g番茄根系，采用RNA提取試劑盒（Invitrogen）提取番茄根系總RNA，并用反轉錄試劑盒（Fermentas）將所提的RNA反轉錄成cDNA，再以實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術進行基因表達分析[11]，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2007進行數據處理，SPSS 17.0進行統計分析，不同小寫字母表示處理間差異顯著（＜0.05）。

2 結果

2.1 黃腐酸對低磷脅迫下番茄幼苗生長和光合作用性能的影響

圖1顯示，與對照相比，低磷脅迫（T0）顯著抑制番茄幼苗的生長（＜0.05），且對根系生長的抑制效應大于莖葉，表現在根冠比下降；并造成葉片花青素沉積加深的癥狀。在低磷脅迫下，隨著黃腐酸施用量的增加（T1—T5），番茄幼苗根系和莖葉的生長量及根冠比均呈現先增后降的趨勢，以T2增幅最大，這與黃腐酸緩解番茄低磷脅迫的表型相吻合；且外源添加黃腐酸也能在一定程度上降低由低磷脅迫引起的葉片花青素沉積。

圖2表明，與對照相比，低磷脅迫（T0）可顯著抑制番茄葉片的PN、葉綠素含量和Fv/Fm，并造成E激增（＜0.05）。表明低磷脅迫可造成葉綠素積累受阻，光能和活躍的電子能過剩，光合電子鏈破壞，進而降低番茄幼苗的光合作用。低磷脅迫下，隨著黃腐酸施用量的增加（T1—T5），番茄葉片的PN、葉綠素含量和Fv/Fm均呈現先增后降的趨勢，且均以T2增幅最大；而EX呈先降后升趨勢，也以T2變化最為顯著。說明外源施用黃腐酸能在一定程度上緩解由缺磷造成的葉片光合作用性能抑制等癥狀。

不同小寫字母表示處理間差異顯著達5%水平，CK、T0—T5分別表示對照，低磷脅迫下添加0、0.04、0.08、0.12、0.16和0.20 g·L-1黃腐酸。下同

2.2 黃腐酸對低磷脅迫下番茄幼苗磷吸收、分配及相關基因表達的影響

圖3顯示，低磷脅迫下，隨著黃腐酸施用量的增加（T1—T5），番茄幼苗根、莖、葉中的磷含量和磷積累及磷吸收總量均呈現先增后降的趨勢，且以T2增幅最大。但根據磷在根、莖、葉中分配比例來看，低磷脅迫使磷分配由根轉向莖，而對葉的影響相對較小；而隨著黃腐酸施用量的增加（T1—T5），根中的磷分配呈先增后降的趨勢，葉片中的磷分配呈先降后增趨勢，而莖中磷分配呈遞增趨勢。這表明外源施用黃腐酸不僅能提高低磷脅迫下番茄幼苗磷吸收能力，還能影響磷在不同器官中的分布。

圖2 黃腐酸對低磷脅迫下番茄葉片凈光合速率、葉綠素含量、暗適應下PSII最大光化學效率和過剩光能的影響

Fig 2 Effects of fulvic acid on PN, chlorophyll content,F/FandEin tomato leaves under P deficiency

圖3 黃腐酸對低磷脅迫下番茄幼苗磷吸收、分配及相關基因表達的影響

植物中存在一系列磷轉運調控基因，其中在根中表達，促進根系從環境中吸收磷酸鹽[13]；而則定位在根系木質部，負責將磷酸鹽裝載至木質部，進而向莖葉組織轉運[14]。圖3顯示，低磷脅迫初期（5 d），和的表達量上升，表明番茄對低磷脅迫具有自主調控與適應機制；而脅迫后期（25 d），和的表達量下降，說明長期缺磷已造成mRNA轉錄受阻。而低磷脅迫下添加黃腐酸，在處理后5 d和25 d時均能顯著提升和的表達水平，其峰值出現在T2處理。

2.3 黃腐酸對低磷脅迫下番茄根系有機酸積累、分泌及相關基因表達的影響

根系通過向環境釋放有機酸，可將難溶態磷轉化為可溶性的磷酸鹽，提高作物對磷的吸收，緩解植物的低磷脅迫[15]。圖4顯示，低磷脅迫下，番茄根系總有機酸含量顯著上升（＜0.05）；除酒石酸外，其余6種有機酸均達到差異顯著水平（＜0.05）。與此對應，低磷脅迫下，根系有機酸的積累使培養液的pH較對照顯著降低（＜0.05）。說明番茄在低磷脅迫下通過根系積累有機酸，并增強有機酸分泌，降低了根系生長介質的pH；這對培養介質的磷素活化和番茄抵抗低磷脅迫具有重要意義。而外源施用黃腐酸可進一步加強根系總有機酸的積累和分泌，以T2效果最佳。但就單一有機酸積累來看，T2處理促進根系草酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和酒石酸的積累，而抑制乳酸和乙酸的積累。

圖4 黃腐酸對低磷脅迫下番茄根系有機酸積累、分泌及相關基因表達的影響

和分別是控制根系H+外排[16]和促進根系發生及植株生長[17]的關鍵基因。圖4顯示，和的表達量在低磷脅迫初期（5 d）上升，后期（25 d）下降；而低磷脅迫下添加黃腐酸，在處理后5 d和25 d時均能顯著提升和的表達水平，以T2和T3較為顯著。

3 討論

許多研究表明，黃腐酸對植物具有促進生長，增強礦質營養吸收和利用，提高光合速率，增強作物抗性等功能，且其生理活性高于一般腐殖酸[18-19]。當前研究觀點認為，黃腐酸乃至腐殖酸具有“生物刺激素”的功能，其發揮功效的原因是黃腐酸中含有一些植物激素類似物[18]。研究表明，土壤添加黃腐酸、腐殖酸、或施用腐殖酸復合肥均能不同程度的增強作物的磷素利用效率[5,7-8]。其作用形式包含3個方面：腐殖酸刺激作物根系的生長，增加土壤耕層根系覆蓋度，增強磷素吸收[6,20]；腐殖酸改變土壤微生物群落或影響作物根系分泌物，影響土壤堿性磷酸酶活性，促進磷素活化[18-19]；腐殖酸利用自身巨大的吸附性能，吸附土壤中易容態速效磷，降低速效磷在土壤中的淋失，達到保磷緩釋的目的[21]。因此在土壤環境中研究黃腐酸提高作物適應低磷脅迫的機制時，難以分清是黃腐酸對植物刺激的直接效應，還是黃腐酸對土壤微生態或磷素影響的間接效應。本試驗采用營養液栽培模式，在無土壤肥力、微生物和土壤酶干擾的條件下，研究黃腐酸在低磷脅迫條件下對番茄幼苗生長、光合作用、磷素吸收和分配，以及有機酸代謝和泌酸行為的影響。因此本研究中黃腐酸的作用應是對番茄幼苗適應低磷脅迫的直接調控效應。

缺磷會造成植物體內生物大分子合成和能量代謝受阻，使光合作用器損傷，降低Fv/Fm，導致光能向化學能轉化受阻，引起EX激增，形成光氧化破壞；進而增強葉綠素氧化降解和PN下降[22]。而細胞組分中磷骨架的缺乏和PN下降引起的碳同化受阻是缺磷抑制植物生長的根本原因[23]。根系對有機酸的積累和分泌是植物適應低磷脅迫的重要生理機制[24]。本研究中黃腐酸緩解番茄上述缺磷癥狀的根本原因在于其能促進根系有機酸的積累和外排，降低培養介質的pH，使與鈣、鎂、鐵等陽離子結合的磷酸鹽沉淀活化，增強根系對磷素的吸收。前人研究表明，多數植物根系在缺磷條件下會積累有機酸，其主要為檸檬酸和蘋果酸，而根系作為有機酸的代謝庫，其有機酸含量與有機酸分泌之間存在顯著正相關[15]。本研究發現，雖然缺磷會導致乳酸和乙酸含量增加，但考慮這兩類有機酸是無氧呼吸產物，且長勢較好的T2處理（0.08 g·L-1黃腐酸）中乳酸和乙酸的含量均低于T0；說明這兩類有機酸不屬于番茄適應低磷脅迫的代謝反應產物，而應作為脅迫后的毒害產物看待[12]。另外，有機酸產生于碳水化合物的異化過程，黃腐酸對低磷脅迫下光合機能的維護也為有機酸的持續產生和外排奠定了物質基礎；因此黃腐酸調控的有機酸積累和光合能力提升在番茄抵抗低磷脅迫過程中形成了相輔相成的良性循環效應。細胞質pH介于7—7.5，根系儲存的有機酸多以有機酸鹽的形式存在，其向根外的分泌需要借助外排的H+，以平衡電荷[16]；但該過程需要消耗ATP，而長期缺磷導致的反應底物不足可能是脅迫后期mRNA合成受阻和ATP代謝障礙的根本原因。

目前，腐殖酸已被證實具有模擬生長素和赤霉素的生理功能[25-26]，而這兩類激素是控制根系發生和植物生長的正向調控因子。是響應生長素[27]和赤霉素[28]的關鍵轉錄因子，其參與了這兩類激素誘導的細胞分裂和膨大進程，具有促進生長和根系發生的作用。本研究發現，黃腐酸能促進的表達，這可能與黃腐酸中含有生長素或赤霉素類似物有關。而的上調表達亦為黃腐酸提高低磷脅迫下番茄的生長勢和根冠比做出了合理的解釋。此外，根冠比的提升一方面增加了番茄幼苗的磷吸收能力，另一方面也有利于形成更大的根系有機酸庫以應對低磷脅迫。缺磷可引起植物赤霉素合成水平下降和DELLA蛋白積累，進而誘發根系構型轉變和花青素沉積[29]。可通過阻斷DELLA恢復赤霉素信號[28]，因此，本研究中黃腐酸對番茄葉片花青素沉積的恢復效應和促根過程可部分歸因于黃腐酸中的赤霉素類似物對表達的正向激活調控，但目前尚難從黃腐酸中分離和鑒定這些激素類似物。此外，PT1和PHO1等磷轉運蛋白不僅可對磷缺乏做出響應，也受到生長素信號的影響[30]；黃腐酸誘導的和表達可能依賴于生長素信號途徑，但確鑿證據尚需進一步驗證。

4 結論

黃腐酸緩解番茄幼苗“遺傳學缺磷”的生理機制在于其蘊含的生長素和赤霉素類似物能激活轉錄因子和磷轉運蛋白相關基因（和），促進植株生長和根系發生。而根系發生促進了養分吸收，并增大了根系有機酸庫和泌酸量，進一步增強磷素的活化和吸收。改善的礦質營養基礎為低磷脅迫下光合作用的進行提供了物質保障，較強的光合作用和碳同化能力在促進植株生長的基礎上保證了有機酸合成的底物和能量的供應，從而形成良性生理循環以抵抗低磷脅迫。

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Physiological Regulatory Effects of Fulvic Acid on Stress Tolerance of Tomato Seedlings against Phosphate Deficiency

ZHANG LiLi, LIU DeXing, SHI QingHua, GONG Biao

(College of Horticultural Science and Engineering, Shandong Agricultural University/Ministry of Agriculture Key Laboratory of Horticultural Crop Biology and Germplasm Creation in Huang-Huai Region, Tai’an 271018, Shandong)

【Objective】Phosphorus is one of the key elements of plant growth and development. Phosphorus deficiency can seriously affect crop yield and quality. Fulvic acid, as a natural organic compound, can promote plant growth and improve plant stress resistance. In order to ascertain the physiological regulatory mechanisms of fulvic acid on stress tolerance of tomato seedlings against phosphate deficiency, we will execute this experiment to explain the mitigative mechanisms of “genetic phosphate deficiency” by fulvic acid in tomato seedlings. It has launched the experiment to study on physiological control of tomato seedlings adapting to low phosphorus stress by fulvic acid. 【Method】 Tomato cultivar of ‘JinPeng No.1’ was used as the tested cultivar, and Hogland nutrient solution hydroponics was used in this experiment. When the tomato seedlings grew to three leaves, they were moved to the hydroponic basin for seven days. We studied the roles of applying different concentrations of exogenous fulvic acid (0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, and 0.20 g·L-1; T0-T5 ) on the growth of tomato seedlings, root development, ability of photosynthesis, uptake and distribution of phosphate, accumulation and secretion of organic acid, and so on under hydroponic environment of phosphate deficiency.【Result】With the increase of the amount of fulvic acid (T1-T5), the physiological indexes of tomato seedlings showed a trend of rising first and then decreasing under low-phosphorus stress. Application of fulvic acid to 0.08 g·L-1had a significant effect on increasing ratio of root to shoot; improving chlorophyll content, photosynthetic performance of leaves, enhancing phosphorus accumulation, distribution and transport in different tissues of tomato，phosphorus transporter-related gene's expression (and).can promote the roots of tomato seedlings to the environment in the uptake of phosphate alleviate low phosphorus stress andcan promote phosphate from root to stem and leaf distribution in order to effectively alleviate the shoot phosphorus deficiency. It can also improve the accumulation and secretion of organic acid (oxalate, malate, citrate, succinate, and tartrate), reducing the roots of anaerobic respiration products of lactic acid and acetic acid, promoting the proton pump gene () expression that can effectively change the environment of insoluble phosphorus to soluble phosphate and increased soluble phosphate content in the environment to promote plant root phosphorus content, improving growth- and development-related gene's expression () as well as decreasing the anthocyanin accumulation. 【Conclusion】Adding fulvic acid at a certain concentration under low-phosphorus stress can significantly improve shoot growth and root development of tomato seedlings. It indicates that the addition of fulvic acid can alleviate the phosphorus deficiency symptoms of plants to a certain extent and reveal the regulation of fulvic acid physiological mechanism of tomato actively against phosphorus deficiency.

tomato; fulvic acid; phosphate deficiency; physiological regulation

（責任編輯 趙伶俐）

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.012

2017-08-29；

2017-11-27

國家自然科學基金（31501779）、山東農業大學泉林黃腐酸肥料工程實驗室開放研發基金（QL2016-3）

張麗麗，E-mail：z1551931811@163.com。

鞏彪，E-mail：gb_gongbiao@163.com