氣相色譜-質譜聯用法同時測定紅棗中六種酚酸

韓雪，張富新，邵玉宇，彭海霞，王畢妮

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

紅棗是鼠李科植物棗樹的果實，具有很高的營養和保健價值[1]。紅棗中含有多種生物活性成分，包括多糖、三萜類、黃酮和酚酸類化合物等[2-5]。酚酸是芳香族羧酸的羥基衍生物，研究表明，酚酸類化合物具有很強的抗氧化活性，在預防心腦血管疾病、癌癥、骨質疏松癥和神經退行性疾病中發揮著重要作用[6-8]。目前棗果中被檢出的酚酸有11種，包括6種羥基肉桂酸型酚酸(咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、肉桂酸、綠原酸、芥子酸)、4種苯甲酸型酚酸(沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸)以及鞣花酸[9]。WABG等[10]在研究棗果各部位不同類型酚酸分布與含量時共發現了8種酚酸；GAO等[11-13]在我國棗果中檢出了7 種酚酸類物質，其組成和含量因品種不同而存在差異。因此，對紅棗中酚酸類化合物的分析檢測具有重要意義。

目前用于酚酸的分析方法主要有分光光度法和高效液相色譜法。張向前等[14]利用紫外分光光度法對紅棗中的9種酚酸進行檢測，但是分光光度法只能測定同類結構的總酚含量, 不能區分結構類似的酚類物質含量。侯麗娟等[15]使用高效液相色譜法對6種不同品種、不同年份的葡萄酒樣品中的12種酚酸進行檢測。HPLC雖然定量準確, 但難以鑒定未知化合物的結構，且分析時間較長。還有利用毛細管電泳[16]和傅立葉近紅外光譜[17]檢測，但是由于檢測復雜等原因這2種方法應用并不多。因此，建立一種能夠簡單快速并且具有較高靈敏度的檢測植物中酚酸類化合物的方法意義重大。

GC-MS分析方法不僅簡單、靈敏度高，還能夠鑒定未知化合物的結構。MILENA[18]等采用GC-MS分析方法對紅酒中的酚酸進行了研究；CHRISTIAN[19]等利用GC-MS分析方法對酚類物質經微生物發酵后的產物進行了分析；趙艷玲[20]建立了GC-MS同時測定植物葉片中的4種酚酸的程序方法。本實驗采用GC-MS分析方法對紅棗中的酚酸進行分析，目的在于建立一種能夠在較短時間內同時測定出紅棗中6種酚酸的方法，并對3種紅棗中這6種酚酸的含量進行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

QP-2010Ultra氣質聯用儀，日本島津；Rtx-5毛細管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm)，美國Agilent公司；分析天平，北京賽多利斯電子天平有限公司；立式離心機，張家港輕工設備廠；旋轉式蒸發器，上海安亭有限公司；HY-4調速多用振蕩器，江蘇金壇市國勝實驗儀器廠；JYL-C93T榨汁攪拌機，九陽股份有限公司。

狗頭棗、灘棗、金絲小棗，均購置于超市；水楊酸(≥99%)、4-羥基苯甲酸(≥99%)、香草酸(≥97%)、2,5-二羥基苯甲酸(≥98%)、原兒茶酸(≥97%)、對香豆酸(≥97%)、BSTFA(含1%的TMCS)，美國Sigma公司；甲醇(色譜純)，上海科密歐公司；乙酸乙酯(分析純)，上海科密歐公司。

1.2 色譜條件

氣相色譜條件：Rtx-5毛細管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm)；分流比20∶1；載氣為高純度氦氣，流速為1.0 mL/min；接口溫度250 ℃，進樣口溫度280 ℃;進樣量為1 μL。色譜柱升溫程序：初始柱溫為100 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，然后再以5 ℃/min上升到250 ℃，保持5 min，總共運行時間為25 min。質譜條件：離子源EI；電離能量70 eV，倍增器電壓350 V；離子源溫度200 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描質量范圍為33～500 m/z，掃描速度0.5 s/次。

1.3 混合標準溶液配制

分別稱取各種酚酸標品0.010 g，配制成0.1 g/L的各標準酚酸儲備液。再對各標準酚酸儲備液進行不同程度的稀釋，分別配制為0.5、1、5、10、20 mg/L的各標準酚酸溶液以待用。

1.4 樣品制備

樣品的制備參考韓國民[21]的方法，略有改動。將紅棗清洗干凈后去核，加水(1∶4，g∶mL)打漿，用與紅棗漿等體積的乙酸乙酯萃取，再在6 000 r/min條件下離心10 min，重復萃取4次后，合并上清液，在45 ℃下真空濃縮，用甲醇定容至10 mL，分裝至離心管中凍存以備用。

1.5 衍生化條件的優化

本實驗采用BSTFA(含1%TMCS)為衍生化試劑，并利用混合標準溶液對衍生化的時間及溫度進行了優化。

1.6 樣品的衍生化處理

取待測液1.0 mL，用氮氣吹干，加入0.5 mL BSTFA(含1%TMCS)在35 ℃下反應30 min。

1.7 酚酸的定性與定量

將采集到的質譜圖與NIST14 標準譜庫及標準品中各種酚酸的保留時間對照進行定性。采用峰面積外標法，對不同濃度的標準混合溶液進行分析，以各組分的峰面積和質量濃度進行一元線性回歸，建立定量工作曲線，根據建立的標準工作曲線進行定量。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜條件的選擇

2.1.1 氣相色譜柱的選擇

色譜柱的選擇基本上要遵循“相似相溶”的基本原理，根據目標化合物的性質選擇合適的色譜柱[22]。酚酸類化合物屬于極性物質，可采用弱極性柱和極性柱，根據柱子的適用溫度范圍及化合物的沸點，弱極性柱 Rtx-5毛細管色譜柱較合適；由于測定的6種酚酸大部分為低揮發性高沸點化合物，但經衍生化后沸點降低，因此選擇薄液膜比較合適。實驗結果表明，Rtx-5毛細管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm)分離效果較好。

2.1.2 柱溫的選擇

在氣相色譜中，柱溫是一個很重要的操作參數，是影響目標物分離效率及分析速度的關鍵條件。根據化合物的沸點，剛開始升溫程序為初始柱溫45 ℃，1～6.5 min以10 ℃/min上升到100 ℃，6.5～26.5 min以7.5 ℃/min上升至250 ℃，再以20℃/min升至300 ℃，保持1 min，總共運行30 min。此時容易受到衍生化試劑峰的影響，2,5-二羥基苯甲酸與香草酸沒有徹底分離，且因為溫度過高而導致基線漂移。當把升溫程序改為以10 ℃/min升至200 ℃，然后再以5 ℃/min上升到250 ℃，保留5 min，總共運行時間為25 min后，不僅衍生化試劑峰的影響降低，且基線平穩，2,5-二羥基苯甲酸也與香草酸分離，還縮短了檢測時間。

2.2 衍生化條件的優化

2.2.1 衍生化試劑的選擇

酚酸類化合物屬于極性化合物，未經衍生化處理直接進樣進行GC-MS分析，色譜峰較少，得不到多酚類物質的譜峰[23]。欒天罡等[24]利用GC-MS對葡萄酒中的多酚類化合進行檢測，發現未經衍生化的樣品直接進樣時沒有得到多酚類化合物的色譜峰。因此，要對多酚類物質進行GC-MS分析，獲得好的出峰效果，必須首先通過衍生化處理降低樣品極性。常見的衍生化法有硅烷化法、酯化法和酰化法，酚羥基的衍生化最常采用甲基硅烷化法[25]。為降低衍生化時間過長而帶來的誤差，本實驗采用硅烷化能力最強的BSTFA作為衍生化試劑。

2.2.2 反應時間對衍生化反應的影響

保持反應溫度為35 ℃不變，在反應時間為15、30、45、60 min時，考察衍生化反應產物隨反應時間的變化情況。如圖1所示，以衍生化產物的色譜峰面積對時間作圖，在15～30 min內，6種酚酸的衍生化產物的峰面積隨反應時間的延長而增大。當反應時間超過30 min后，色譜峰面積均不斷減小，可能是衍生化反應產物隨著時間的延長而變得不穩定，容易生成衍生化副產物[26]。經過比較，最終選擇的衍生化時間為30 min。

圖1 不同反應時間的衍生化產物色譜信號
Fig.1 The chromatographic response of derivatives to different reaction time

2.2.3 反應溫度對衍生化反應的影響

保持反應時間為30 min不變的情況下，在反應溫度為25、35、45、55 ℃時，考察衍生化反應產物隨反應時間的變化情況。如圖2所示，以衍生化產物的色譜峰面積對溫度作圖，在25～35 ℃內，6種酚酸衍生化產物的峰面積隨反應時間的延長而增大。當溫度超過35 ℃后，色譜峰面積均不斷減小，可能是衍生化產物隨著溫度的升高而變得不穩定[26]。經過比較，最終選擇的衍生化溫度為35 ℃。

圖2 不同反應溫度的衍生化產物色譜信號
Fig.2 The chromatographic response of derivatives to different reaction temperatures

2.3 線性關系及檢出限

取1.0 mL按1.3方法配制的6種酚酸的混合標準溶液，衍生化后從低濃度到高濃度依次進樣，按照1.2的色譜條件進行檢測，所得色譜圖見圖3。利用酚酸的濃度與對應的峰面積繪制標準曲線，并對所得的標準曲線進行線性回歸。將混合標準溶液用甲醇逐級稀釋，當色譜峰的峰高為噪音的3倍時,得出6種酚酸的檢出限，實驗結果見表1。

峰：1：水楊酸；2:4-羥基苯甲酸；3：香草酸；4:2,5-二羥基苯甲酸；5：原兒茶酸；6：對香豆酸
圖3 6種酚酸混合標準溶液的色譜圖
Fig.3 The chromatogram of a mixture of 6 kinds of phenolic acids

由圖3可以看出，6種酚酸的分離效果較好，且保留時間比較集中，分別為8.363、9.831、11.508、11.598、12.200、13.937 min。由表1可以看出，6種酚酸的峰面積與質量濃度的相關系數都在0.994～0.999之間，在濃度范圍之內線性關系良好。此外，6種酚酸的檢出限分別為2、4、3、2、1、6 μg/L，說明檢測的靈敏度較高。

2.4 精密度測試

以濃度為10 mg/L的混合標準溶液連續進樣5次，根據所得峰面積計算精密度，結果見表2。6種酚酸的RSD分別是2.9%、3.0%、4.0%、2.3%、4.8%、3.8%，均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.5 樣品回收率

選擇狗頭棗為加標基質，加入混合標準溶液，按照1.4和1.5對樣品進行處理及衍生化，再按照1.2的色譜條件進行檢測。根據測出的標準品的量與加入標準品的量來計算回收率，所得結果見表3。由表3結果可得，6種酚酸的平均回收率分別為92.6%、98.4%、104.3、100.1%、95.4%、98.6%，證明該方法的準確性較高，可以用于檢測紅棗中酚酸的檢測分析。

2.6 樣品分析結果

將3種不同品種的紅棗按照1.4和1,5進行處理及衍生化，再按照1.2的色譜條件進行檢測，得到其色譜圖(圖4)，檢測結果如表4所示。由表4可以看出，除2,5-二羥基苯甲酸外，其余5種酚酸在3種紅棗中均被檢出，檢測到酚酸的總量在22.88～30.51 mg/kg之間。不同品種紅棗中的酚酸含量均存在一定差異，水楊酸在每種品種的紅棗中含量相對較高，占酚酸總量的35.6%～40.1%。水楊酸與香草酸是狗頭棗中主要的酚酸物質，占酚酸總量的74.6%；金絲小棗中水楊酸含量最高，其次為原兒茶酸與對香豆酸，共占酚酸總量的79.5%；灘棗中水楊酸與4-羥基苯甲酸含量較高，占酚酸總量的64.4%。WANG等[27]在5種不同品種的紅棗(哈密大棗、木棗、狗頭棗、金絲小棗、灘棗)中檢測出沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸和對香豆酸。

表1 酚酸標準曲線Table 1 Standard curve of phenolic acid

表2 精密度實驗(n=5)Table 2 Results of precision experiments (n=5)

表3 回收率試驗Table 3 Recovery test

表4 紅棗樣品中酚酸的含量 單位：mg/kg

峰：1：水楊酸；2:4-羥基苯甲酸；3：香草酸；4：2,5-二羥基苯甲酸；5：原兒茶酸；6：對香豆酸；A-狗頭棗；B-灘棗；C-金絲小棗
圖4 三種紅棗樣品中6種酚酸的色譜圖
Fig.4 Chromatograms of six phenolic acids in three jujube samples

3 結論

(1)本實驗采用氣相質譜聯用法對紅棗中的6種酚酸的檢測條件進行篩選，并對衍生化的條件進行了優化，確定了最佳衍生化時間和溫度為30 min和35 ℃。使用Rtx-5毛細管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm)進行分離，升溫程序為初始柱溫100 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，然后再以5 ℃/min上升到250 ℃，保持5 min，總共運行時間為25 min。實驗結果表明，該方法可以快速有效的對紅棗中6種酚酸進行定性定量分析，并且該方法的線性關系良好，回收率為92.6%～104.3%，儀器精密度均小于5%，方法檢出限也能夠滿足檢測要求。

(2)使用該方法對狗頭棗、金絲小棗及灘棗中的此6種酚酸進行分析。檢測結果顯示在此3種品種的紅棗中均檢測到了水楊酸、對羥基苯甲酸、香草酸、原兒茶酸和對香豆酸，不同品種的紅棗中所含酚酸的含量各不相同。其中水楊酸的含量在每種紅棗中的含量均比較高，占檢測到的酚酸總量的35.6%～40.1%。說明該方法適用于紅棗中此6種酚酸的檢測。