釀造醬油中特征氨基酸含量檢測及對氨基酸態氮貢獻的分析

梁寒峭，陳建國，劉偉，馬保文，榮長遠，程池*

1(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京， 100015) 2(聊城正信生態農業科技園有限公司，山東 聊城， 252000)

釀造醬油(fermented soy sauce)是以大豆和/或脫脂大豆、小麥和/或麩皮為原料，經微生物發酵制成的具有特殊色、香、味的液態調味品。最早的醬油由肉類腌制而成，稱為“醢”[hǎi]，后逐步改良發展，以豆類為主要原料制成的成品風味相似且成本較低。無添加釀造醬油中的鮮味物質主要來源于原料中的蛋白質經微生物代謝分泌產生蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶等多酶系作用，生成各種氨基酸，其中以谷氨酸的鮮味最突出。目前，市售的醬油多有添加谷氨酸鈉(味精)的現象，此舉除了增加醬油的鮮味外，還可以大幅度提高氨基酸態氮的含量，從而顯著提高醬油的等級。根據報道，普通無鹽味精中的氨基酸態氮含量為7.27 g/100g[1]，500 mL醬油中外添加10 g味精即可提高氨基酸態氮0.15 g/100g，在氨基酸態氮的指標上將一款一級醬油輕松地提升為特級醬油，成本卻只需要2角錢。

隨著人類社會的進步和社會經濟的不斷發展，人們的生活水平也越來越高，調味方式的改變也逐漸成為健康飲食的要素之一，人們從片面追求色、香、味的傳統調味方式轉而向講究原色、原汁、原味的現代健康調味方式[2-3]。目前在我國，無添加釀造醬油還沒有相關標準，均執行釀造醬油國標，并且市場較為混亂，名稱繁多，有稱零添加醬油(0添加)或純釀醬油等，但其含義均指大豆、小麥等原料經微生物發酵結束后，不再使用任何食品配料、食品添加劑等進行調配，制備而成的釀造醬油。無添加釀造醬油配料表中只含有大豆或脫脂大豆、小麥和(或)麩皮、食鹽等原料，不含有白砂糖、酵母提取物等食品配料，以及甜味劑(三氯蔗糖、安賽蜜等)、增鮮劑(谷氨酸鈉、5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉等)、防腐劑(苯甲酸鈉、山梨酸鉀等)、焦糖色素等。

目前，在國標GB 18186—2000《釀造醬油》中規定：醬油等級的理化指標主要包含3項，分別為可溶性無鹽固形物、全氮和氨基酸態氮。第2號修訂單中又進一步要求自2002年1月31號起醬油產品標簽中，要標明氨基酸態氮的含量和質量等級，因此，氨基酸態氮成為國標規定的釀造醬油品質指征的3大指標中唯一被標注在產品標簽上的數據，因此其數值的高低很大程度上成為消費者在醬油選擇中的最主要依據。但隨著現代食品工業科技的發展，谷氨酸鈉、呈味核苷酸等食品添加劑的應用增多，氨基酸態氮的表觀數值已經不能全面反映釀造醬油的真實營養價值。本研究分別對有無食品添加劑的不同種類醬油的氨基酸種類、氨基酸構成比例和氨基酸態氮組成等多方面進行了系統研究，為釀造醬油的品質鑒別提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品材料1號由山東正信生態農業科技園有限公司提供，樣品材料2號和3號購自北京超市，具體信息見表1。

表1 樣品材料的基本信息Table 1 Essential information of samples

17種氨基酸標準液(0.002 50 mol/L，Sigma)；濃鹽酸(濃度≥36%)；冰乙酸，檸檬酸鈉和氫氧化鈉(優級純)；濃硫酸，重蒸酚，茚三酮，還原茚三酮，氫氧化鋰，二甲基亞砜，乙酸鋰，硝酸銀，鉻酸鉀，甲基紅，澳鉀酚綠，硫酸銅，硫酸鉀，硼酸，甲醛，冷凍劑(市售食鹽與冰按1∶3質量比混合)；高純氮氣(99.99%)。全部試劑除注明外均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

日立L-8900 高速氨基酸分析儀，日本日立公司；日立鈉離子交接樹脂(4.6 mm×60 mm)，日本日立公司；LG10-24A變速臺式離心機，德國Eppendorf公司；R5真空泵，德國普立；DHG-9035A恒溫干燥箱，北京恒泰豐科；酸度計(附磁力攪拌器)，凱氏燒瓶；冷凝器；氮球。

1.3 方法

1.3.1 醬油中的游離氨基酸分析方法

參照《食品中氨基酸的測定GB 5009.124—2003》[4]。

1.3.2 醬油中可溶性無鹽固形物含量檢測

參照《釀造醬油GB 18186—2000》6.2可溶性無鹽固形物部分；全氮含量檢測參照《釀造醬油GB 18186—2000》6.3全氮部分；氨基酸態氮含量檢測參照《釀造醬油GB 18186—2000》6.4氨基酸態氮部分[5]。

1.3.3 醬油低聚肽含量檢測

參照《海洋魚低聚肽粉 GB/T 22729-2008》6.3低聚肽部分[6]。

1.4 數據計算

1.4.1 游離氨基酸對氨基酸態氮的貢獻值的轉換計算方式

非酸性氨基酸對氨基酸態氮的貢獻值=氨基酸含量/氨基酸分子量×14

酸性氨基酸對氨基酸態氮的貢獻值=氨基酸含量/氨基酸分子量×14×2

1.4.2 低聚肽對氨基酸態氮的貢獻值的轉換計算方式

分子質量140 Da以下低聚肽對氨基酸態氮的貢獻值=低聚肽含量/平均分子質量140×14

分子質量140～500 Da以下低聚肽對氨基酸態氮的貢獻值=低聚肽含量/平均分子質量320×14

分子質量500～1 000 Da以下低聚肽對氨基酸態氮的貢獻值=低聚肽含量/平均分子量750×14

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸的含量分析

采用全自動氨基酸分析儀對3個樣品中的17種氨基酸的種類和含量進行檢測分析，結果見表2。3個樣品的氨基酸總量分別為3.875 g/100 mL、6.041 g/100 mL和2.341 g/100 mL，2號樣品最高；但考慮2號樣品配料表中明確標注添加谷氨酸鈉，排除谷氨酸干擾后，3款醬油的氨基酸總量分別為3.494 g/100 mL、3.062 g/100 mL和2.106 g/100 mL，無添加的1號樣品氨基酸總量最高。

釀造醬油中的谷氨酸占總氨基酸的比例一般在18%～25%，超過此范圍多為外添加谷氨酸鈉增鮮劑所致[7-8]。本研究中3個樣品的谷氨酸占比分別為9.83%、49.31%和10.04%，2號樣品谷氨酸占比超出常規范圍近1倍，對照其配料表推斷與其添加的谷氨酸鈉和各類增鮮劑相關。谷氨酸鈉成本低廉，谷氨酸作為釀造醬油的特征氨基酸，其含量及占比范圍可用作初步判斷產品是否添加增鮮劑的指標之一。

表2 釀造醬油樣品中的氨基酸組成 (g/100 mL) (n=3, X±sd)Table 2 Free amino acids composition of fermentedsoy sauce

注：*必需氨基酸

在所檢測的16種氨基酸中(不計谷氨酸)，13種氨基酸在1號樣品中含量最高，此外甘氨酸和組氨酸在1號和2號樣品中基本無差異，只有天冬氨酸在2號樣品中的含量顯著高于1號樣品，3號樣品游離氨基酸含量普遍偏低。有研究表明，在配制醬油和植物蛋白水解液中天冬氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸4種氨基酸含量接近，占總氨基酸(不計谷氨酸)比例的總和較高，分別為47.85%和55.52%[8]；本研究中的3個樣品4種氨基酸占比總和分別為25.41%、26.88%和25.02%，與前期研究中釀造醬油的含量27.42%相符[9]，且4種氨基酸間的含量差異性較大，表明3款醬油確為釀造醬油。

在排除谷氨酸干擾下，3個樣品的氨基酸種類分布基本一致，亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量分布在9%～11%范圍內，是釀造醬油中的主要氨基酸；丙氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、甘氨酸分別分布在6%～9%和3%～6%范圍內；胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和精氨酸含量一般低于3%。天冬氨酸在3款醬油中含量差異較大，2號醬油含量最高，是1號和3號樣品的1.71和1.83倍。

圖1 釀造醬油樣品中各氨基酸占總氨基酸的百分比(以谷氨酸計)
Fig.1 Free amino acids proportion in fermented soy sauce (including glutamic acid)

2.2 必需氨基酸組成分析

3個樣品中必需氨基酸總量分別為2.08、1.76和1.12 g/100 mL，其中，無添加的1號樣品必需氨基酸占比最高為53.65%，2號樣品最低為29.18%；在排除谷氨酸后，3個樣品的必需氨基酸占比基本一致。根據 WHO/FAO 提出的理想蛋白質中 E/T 為 40%左右，E/N 在 60%以上的要求[9]，樣品1中氨基酸的組成最理想，7種必需氨基酸含量均高于2號和3號樣品，是2號樣品的1.08～1.27倍，3號樣品的1.48～2.19倍。

表3 釀造醬油中必需氨基酸總量占總氨基酸含量的百分比(n=3, X±sd)Table 3 Essential amino acids proportion in fermentedsoy sauce

注：EAA必需氨基酸總量， E/T必需氨基酸總量/氨基酸總量，E/N必需氨基酸/非必需氨基酸。

圖2 釀造醬油樣品中各必需氨基酸含量
Fig.2 Essential amino acids content in fermented soy sauce

賴氨酸是幫助其他營養物質被人體充分吸收和利用的關鍵物質, 科學家稱其是人體“第一必需氨基酸”和“最特別的、不可缺少的氨基酸”，其在谷物食品中含量較低，且易被破壞，故被稱為第一限制性氨基酸[10]。本研究中3個樣品的賴氨酸含量分別為0.35、0.28和0.16 g/100 mL，占總氨基酸的9.14%、4.62%和6.92%，其中1號分別是2號樣品和3號樣品的1.98倍和1.32倍。由此可見，釀造醬油中的必需氨基酸種類和含量均很豐富，在無外添加氨基酸的情況下通過釀造工藝即可達到均衡的分布水平，更符合人體的需求。

2.3 氨基酸態氮組成

依照國標GB 18186—2000《釀造醬油》方法對3個樣品的氨基酸態氮、全氮和可溶性無鹽固形物進行測定，檢測結果表明3款醬油的等級均與其產品標簽標注相符，1號和2號樣品為特級醬油，3號樣品為三級醬油。其中2號醬油氨基酸態氮最高為1.42 g/100mL，比1號無添加特級醬油高0.48 g/100mL。

由于氨基酸態氮現已成為評判釀造醬油品質的重要指標之一，因此對其構成的剖析顯得尤為重要。氨基酸態氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，主要由游離氨基酸和小分子低聚肽中的氮元素構成，國標中采用甲醛法滴定得到氨基酸態氮的檢測值，結果見表4。將17種游離氨基酸和低聚肽的檢測結果換算為以氮元素計的氨基酸態氮值，得到三款醬油中氨基酸態氮的組成結構，所有單品種游離氨基酸和小分子低聚肽對氨基酸態氮的貢獻分布見圖3。

表4 釀造醬油中氨基酸態氮、全氮和可溶性固形物的檢測結果和氨基酸態氮組成分析(n=3, X±sd) 單位：g/100mL

注：氨基酸態氮檢測值(不計谷氨酸)=氨基酸態氮檢測值-谷氨酸貢獻值

圖3 釀造醬油中氨基酸態氮的主要構成
Fig.3 Amino nitrogen composition in fermented soy sauce

從結果可知，3個樣品的氨基酸態氮計算值(包括谷氨酸)分別為0.91、1.16和0.47 g/100 mL，1號和3號樣品的計算值與檢測值基本相符，說明這兩個樣品的氨基酸態氮主要由游離氨基酸和低聚肽貢獻，2號樣品的檢測值比計算值高0.26 g/100mL推斷其中仍有18.31%由大分子蛋白貢獻。

2號樣品氨基酸態氮檢測值最高為1.42 g/100mL，但其中0.57 g/100mL由谷氨酸貢獻，貢獻率高達40.14%；1號樣品和3號樣品的谷氨酸貢獻率僅為7.45%和9.52%。排除谷氨酸干擾不計后，2號樣品氨基酸態氮降至0.85 g/100mL，與1號樣品含量相當。此外2號樣品全氮值亦為最高為1.97 g/100mL，比1號樣品高23.90%，但排除谷氨酸的貢獻值后比1號樣品反低7.90%。由此可見，2號樣品雖氨基酸態氮和全氮檢測值雖為最高，但主要由谷氨酸貢獻，且其中相當部分為外源添加。

本研究中3個樣品的總游離氨基酸對氨基酸態氮的貢獻值由高到低順序為2號樣>1號樣>3號樣，2號樣品為66.20%；但排除谷氨酸干擾后，1號和3號樣品的貢獻率變化不大，2號醬油的貢獻率下降至26.41%，比1號樣品低18.62%。

釀造醬油的主要原料大豆或黃豆中的大豆蛋白在經過多種微生物區系和酶系的分解作用下生成豐富的游離氨基酸和低聚肽，其中分子質量1 000 Da以下的小分子低聚肽是預消化的蛋白質，可直接吸收，并且在酸性環境或加熱處理的情況下，仍保持穩定，不會被破壞。比大分子蛋白質更易消化，吸收利用率更高，營養作用更強。在本研究中，1號樣品3類小分子低聚肽對氨基酸態氮的貢獻均高于另兩個樣品，總貢獻值分別是2號和3號樣品的1.95倍和2.39倍。

上述結果均表明，氨基酸態氮含量高并不一定代表氨基酸、低聚肽類營養物質豐富，外部添加的增鮮劑如谷氨酸鈉也會對這一表征指標有顯著影響。3款釀造醬油在排除谷氨酸干擾后，1號和2號兩款特級醬油氨基酸含量基本相等，均顯著高于3號的三級醬油，但三個樣品氨基酸的分布趨勢基本一致。研究表明，無增鮮劑外添加的釀造醬油氨基酸態氮基本可達到0.8 g/100 mL的特級水平，但能超過1.0 g/100 mL的產品卻非常少，醬油中主要的含氮成分是游離氨基酸及肽，其中游離氨基酸占50%～75%，肽占15%～35%，還有部分為銨態氮[11-12]。游離氨基酸和低聚肽做為醬油主要的營養成分和呈味物質，其組成成分和比例直接影響醬油的品質。

對于消費者知道來說，氨基酸態氮的高低是辨別醬油優劣等級最直觀也是最重要的一個指標。正常條件下，提高醬油等級和品質，增加氨基酸態氮含量需要篩選更優質的原料、提升釀造工藝和增加發酵時間，但隨之會大大提高生產成本；另有部分企業通過添加成本遠低于釀造醬油的味精，以增加氨基酸態氮含量，增鮮、提級、降成本三不誤，且其屬于國家允許的添加劑，因此眾多特級醬油都有可能是添加有谷氨酸鈉成分的“加料醬油”[13]。在以往的研究中多關注釀造醬油的真偽鑒別，而在符合釀造醬油標準的產品中如何正確認識氨基酸態氮數值的指征含義以及現有釀造醬油等級的評價標準體系是否可以滿足市場發展的要求方面探討尚有欠缺，本研究從氨基酸態氮的組成解析角度提出了新的研究思路。

3 結論

通過對3個釀造醬油樣品的氨基酸含量、構成和氨基酸態氮組成分析，結果表明2號樣品雖然各項檢測指標最高，但排除谷氨酸干擾后均低于無添加的1號樣品，2號樣品谷氨酸對氨基酸態氮的貢獻率高達40.14%。谷氨酸做為醬油中最主要的鮮味氨基酸，其含量范圍可用于初步判定產品是否外添加增鮮劑。不計谷氨酸后，3款釀造醬油各氨基酸含量相對分布均勻。目前醬油產品包裝中標注的氨基酸態氮雖均能達到國家標準，但僅以此來衡量醬油品質并不能準確全面地體現產品質量。