響應面法優化鱘魚精蛋白肽的酶解提取

白嬋，饒丹華,2，熊光權，磨定信，張金木，王寶華，李寧，廖濤*

1(湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所/湖北省農產品輻照工程技術研究中心，湖北 武漢，430064) 2(武漢工程大學 化學與環境工程學院，湖北 武漢，430073)3(武漢鱘龍生物科技有限公司，湖北 武漢，430015)

合成藥物和添加劑總是伴隨有一定的毒性，通過適當的方法分離天然活性物質不僅可以保持功能活性物質，還可大大降低對機體的致毒性和免疫性，并且分子質量越小安全性越高吸收也越好，因此，小分子質量的天然活性蛋白肽類近年來越來越成為研究重點。CHEN[1]等人發現大豆多肽具有良好的抗氧化性，可以顯著抑制脂質的過氧化進程。MOURE等[2]的研究表明不同分子質量的大豆多肽組分當中，分子質量小于10 kDa的組分抗氧化活性最強。

魚精蛋白是魚類精巢組織當中一類具有多種藥用功能的蛋白質，并且在體外心臟循環手術當中充當重要的抗肝素劑[3]，此外還具有良好的抑菌譜特性，早在1937年M UYTTENDAELE就報道了魚精蛋白具有抗菌活性[4]。魚精蛋白作為異種蛋白在臨床上仍有過敏反應發生[5]，王萬娟等[6]就曾報道魚精蛋白致使過敏者出現毛細血管滲漏綜合征。劉妍妘[7]通過ELISA和Western-blotting分析確定了大黃魚魚精中的主要過敏原為12 kDa的蛋白組分。通過酶解，降低活性蛋白分子量可以有效避免過敏。

目前為止除了王勇剛等[8-9]鮮少有酶解魚精蛋白多肽的研究，現在我國已成為世界鱘魚第一養殖大國，年產量約15 000 t，鱘魚向來以高營養價值著稱，蛋白質含量高，8種必需氨基酸評分均超過WHO推薦的成人氨基酸需要量模式[10]。鱘魚-甲骨板是達氏鰉和史氏鱘的雜交品系，由于其生長快，抗病力強，已在湖北省乃至全國廣泛人工養殖。且甲骨板精巢組織(俗稱魚白)較大，約占魚體重的8%，本實驗對淡水鱘魚-甲骨板精蛋白肽的酶解工藝進行探究，通過構建優化方案制備魚精蛋白肽，為相應產品的開發提供基礎，提供鱘魚加工副產物的綜合價值，從而推動鱘魚產業鏈的快速發展。

1 材料與方法

1.1 材料來源與主要試劑

1.1.1 原料及來源

鱘魚(AcipensersturioLinnaeus)魚白(固態組織)由武漢鱘龍生物科技有限公司于2016年春季提供。

1.1.2 主要試劑

胃蛋白酶(3 000 U/mg)，木瓜蛋白酶(650 U/mg)，胰蛋白酶(650 U/mg),Sigma-Aldrich公司；NaCl，濃H2SO4，乙醇，乙醚，異丙醇等(分析純)，國藥集團。

1.2 儀器與設備

GL-25MS高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，武漢科爾儀器設備有限公司；凱氏定氮裝置，蜀牛化玻儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鱘魚魚精蛋白肽的提取[11-12]

鱘魚魚白解凍后置于高速組織搗碎機中搗碎，稱取10 g加入100 mL 0.14 moL/L NaCl溶液，勻漿1 min后，冰浴中攪拌20 min，靜置10 min，4 000 r/min低溫(0 ℃)離心分離10 min，棄去上清液。重復上述操作1次，棄去上清液。沉淀用體積比為2∶2∶8的乙醚-異丙醇-蒸餾水脫脂浸提液在恒溫搖床中脫脂3 h，重復脫脂1次，離心棄上清液。

沉淀按一定比例加水勻漿，加入一定量活性的酶，調至最佳pH，在一定溫度恒溫水浴酶解一定時間。結束用沸水浴滅酶10 min，冷卻后5 000 r/min低溫(0 ℃)離心15 min，取上清液冷凍干燥。以水解度為指標指示工藝選擇。

1.3.2 檢測方法

蛋白氮含量測定：凱氏定氮法[13]。

游離氨基氮含量測定：甲醛滴定法[14]。

(1)

式中：DH,水解度；A0，原料蛋白氮含量；A1酶解游離氨基氮含量；A2，酶解液游離氨基氮含量。

1.3.3 單因素試驗

選用木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶對樣品進行酶解，隨后繼續對最佳蛋白酶酶解實驗的加酶量、液料比、酶解時間、pH值、酶解溫度值等條件進行單因素實驗。

(a)選酶。原料按液料比20∶1加入蒸餾水，對應調至木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶最適pH值，分別加入24 000 U/g加酶量的木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶。30 ℃恒溫提取2 h。每組3個平行。

(b)加酶量。原料按液料比20∶1加入蒸餾水，調pH值至6.3，分別加入1.5%, 2%, 3%, 4%, 6%, 8%的木瓜蛋白酶。30 ℃恒溫提取2 h。每組3個平行。

(c)液料比。原料分別按液料比10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1加入蒸餾水，調pH值至6.3，加入3%的木瓜蛋白酶。30 ℃恒溫酶解2 h。每組3個平行。

(d)酶解時間。原料按液料比20∶1加入蒸餾水，調pH值至6.3，加入3%的木瓜蛋白酶。30 ℃恒溫提取，提取時間分別為2，4，6，8，10 h。每組3個平行。

(e)pH值。原料按液料比20加入蒸餾水，調pH分別為4、5、6、7、8，加入3%的木瓜蛋白酶。35 ℃恒溫酶解2 h。每組3個平行。

(f)酶解溫度。原料按液料比20∶1加入蒸餾水，調pH值至6.3，加入3%的木瓜蛋白酶。在30、40、50、55、60、70 ℃下分別恒溫酶解2 h。每組3個平行。

1.3.4 響應面試驗

根據單因素試驗結果，采用響應面法依據Box-Behnken試驗原理設計3因素3水平試驗[15]，進一步優化最佳工藝條件。檢測指標為魚精蛋白肽水解度，試驗編碼和水平如下表所示。

表1 響應面分析因子及水平Table 1 Analysis factors and levels in Box-Behnken design

1.3.5 蛋白肽的抑菌實驗

采用濾紙片法[16-17]測試提取蛋白多肽的抑菌性，用無菌水作空白對照。

1.4 數據處理

單因素實驗數據采用Origin 8.0軟件處理作圖，響應面實驗數據采用Design-Expert V8.0.6軟件處理分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1-A可看出，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶均能夠使鱘魚魚白中的蛋白肽鍵斷裂，產生一定的水解度，其中木瓜蛋白酶的水解程度最佳，可以獲得更多小分子質量魚精蛋白肽，遠優于胃蛋白酶。可能是魚精蛋白中主要成分為精氨酸、賴氨酸和組氨酸，而木瓜蛋白酶相對另外2種酶與這3種氨基酸具有較好的結合能力。采用木瓜蛋白酶試驗加酶量、液料比、酶解時間、pH值、酶解溫度等工藝條件對水解度的影響如圖1-B～圖1-F所示。

木瓜蛋白酶添加量對蛋白的水解度影響顯著，在未達到3%添加量時，底物充足，少量添加酶都可以迅速提高水解進程，但達到3%后底物的酶解達到飽和，酶的繼續增多只會引起水解度在一定范圍內上下波動，此外基于經濟考慮，酶添加量3%最合適。圖1-C說明酶解的液料比具有峰形規律，鱘魚魚白溶液過濃過稀都不利于酶解反應的進行。過濃使得溶液黏性大，阻礙了酶與底物的傳質過程；過稀又使得酶與底物結合的效率降低，因此在液料比30∶1時，水解度達到峰值，條件最佳。圖1-D表明，酶解時間適當延長可使酶解更充分，但達到8 h后，由于蛋白水解達到飽和平衡，繼續酶解作用不大，因此最佳酶解時間為8 h。酶解過程溶液的pH值和溫度同樣對酶解過程有影響，且均是在較低區域產生較大影響，pH值和溫度由低增大，水解程度呈現先快速提高后輕微下降的趨勢。pH值和溫度主要對木瓜蛋白酶的活性產生影響，在pH值為7.0，溫度55 ℃的溶液環境中，木瓜蛋白酶的活性最大，制備小分子蛋白肽的效果也最佳。

圖1 單因素對魚精蛋白水解度的影響
Fig.1 Effect of single factors on protamine hydrolysis degree

2.2 響應面試驗

2.2.1 設計及結果

根據Box-Behnken 實驗原理，以水解度DH為響應值，以加酶量A，酶解時間B，液料比C組成的3因素3水平響應面實驗水解度的結果如表2所示。

表2 試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design and results

續表2

2.2.2 響應面模型可靠性分析

Design-expert軟件通過擬合的回歸模型，得出蛋白水解度關于加酶量A、酶解時間B和液料比C的多元二次回歸方程為：

DH=-30.129 75+7.642 00A+5.885 50B-0.040 450C+0.165 00AB-0.025 500AC+0.012 250BC-1.307 00A2-0.416 75B2+4.325E-4C2

軟件對試驗數據進行多項擬合得到魚精蛋白肽提取工藝的模型分析參數見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

為了檢驗構建模型的有效性，如表3所示對模型進行方差分析[18-19]。模型F值為24.32表明模型是顯著的，由噪聲引起的系統誤差僅有0.02%的發生概率。當p值大于0.1時表示該模型項對水解程度的影響不顯著，而本預測模型p值遠小于0.05說明模型條件具有顯著性，該模型中A，B，AC，BC，A2，B2均是顯著影響項。失擬項的F值為0.4表示與誤差相關的失擬項不顯著，且模型R2=0.969 0，預測模型與實際情況的吻合度達到96.9%，綜上，該預測模型可以良好準確地反映實際工藝情況，分析得出的最佳酶解工藝科學性、準確性和可靠性高。

2.2.3 響應面因素分析

預測模型對各個因素項和因素交互項進行的顯著性分析結果如下：

表4 回歸模型系數的顯著性檢驗Table 4 Coefficients of the regression model and theirsignificance test

由表4可知，回歸模型中，因素A(加酶量)的p值=0.000 8遠小于0.01，表明加酶量對鱘魚魚精蛋白的水解影響極其顯著。因素B(酶解時間)的p值為0.01<0.038 8<0.05，表明酶解時間對鱘魚魚精蛋白水解度影響較為顯著，因素C(液料比)的p值為0.061 8，大于0.05，表明液料比對鱘魚魚精蛋白的水解影響不顯著，可以得知底物物料和酶量一定且酶解足夠長時間如8 h時，底物溶液的濃度不會顯著影響蛋白水解的平衡，只是會影響酶解過程達到平衡的時間快慢。單因素實驗中酶解時間僅為2 h，酶解過程不充分，所以濃度適當增大既減少溶液的粘滯阻力又有足夠大的碰撞概率，會對酶解過程的水解度產生較大影響，與8 h的不明顯影響相區別。3個因素對水解度的影響依次為：加酶量>酶解時間>液料比。交互項的影響依次為：AC>BC>AB[20]，AC、BC對水解度影響均較為顯著。二次項中的B2、A2對水解度的影響極其顯著，p值均小于等于0.000 1，說明加酶量和酶解時間是酶解工藝中必須要重點控制的條件。二次項3個因素顯著性：B2>A2>C2。以上說明加酶量、酶解時間、液料比三個因素之間相互影響，并不是簡單的線性關系。

2.2.3 二次交互項分析

加酶量、酶解時間和液料比兩兩交互作用對魚精蛋白水解度的影響情況如圖2～圖4所示。

由圖可知加酶量與液料比、液料比與酶解時間之間的交互作用較強，等高線圖均呈明顯的橢圓形，結果與上表的p值結果一致。而加酶量與酶解時間的等高線圖顯示類似圓形，加酶量與酶解時間交互作用較小，二者線性作用關系較強，對魚精蛋白水解度產生疊加影響。

圖2 液料比為30時，酶解時間和加酶量對魚精蛋白水解度的影響
Fig.2 Effect of enzyme extraction time and pepsin amount on the extraction rate of protamine, when solvent-to-solid ratio is 30

圖3 酶解時間為8 h時，液料比和加酶量對魚精蛋白水解度的影響
Fig.3 Effect of solvent-to-solid ratio and pepsin amount on the extraction rate of protamine, when enzyme time is 8 hours

圖4 加酶量為3.0%，液料比和酶解時間對魚精蛋白水解度的影響
Fig.4 Effect of solvent-to-solid ratio and enzyme extraction time on the extraction rate of protamine, when pepsin amount is 3.0%

2.2.4 最佳工藝及驗證

響應面軟件經過擬合分析得到鱘魚精蛋白肽的最佳提取工藝為：液料比為39.72∶1，木瓜蛋白酶添加量3%，酶解時間8.22 h，此時預測的魚精蛋白水解度最大為5.36%。

經重復驗證試驗證明，在預測模型最佳提取工藝條件下，實際的魚精蛋白水解度平均達到5.44%，與模型預測值極為接近，證明最佳工藝預測值準確。

2.2.5 抑菌性分析

最優工藝條件下，1%濃度的魚精蛋白肽溶液浸泡濾紙處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養基有明顯的抑菌圈，蒸餾水浸泡的濾紙片周圍菌落生長不受影響沒有抑菌圈，魚精蛋白肽抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌效果顯著，如圖5、圖6所示。

圖5 魚精蛋白肽與對照組對大腸桿菌的抑制作用
Fig.5 Inhibitory effect of protamine peptide and the contrast against Escherichia coli

圖6 魚精蛋白肽與對照組對金黃色葡萄球菌的抑制作用
Fig.6 Inhibitory effect of protamine peptide and the contrast against Staphylococcus aureus

3 結論

本文首次對鱘魚精蛋白功能活性肽進行提取，對比發現木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶對魚精蛋白酶解的影響存在明顯差異，其中木瓜蛋白酶的酶解效率最高，在單因素條件實驗基礎上進一步利用Box-Behnken試驗設計原理構建鱘魚精蛋白肽酶解工藝的響應面模型，并通過回歸分析優化得到最終的提取工藝為：液料比為39.72，木瓜蛋白酶添加量3%，酶解提取環境為pH 7.0，溫度55 ℃，酶解反應時間8.22 h。并且驗證實驗表明最佳工藝條件下魚精蛋白水解度最大達到5.44%。所制備的鱘魚精蛋白肽對常見致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌圈，抑菌活性良好，對鱘魚精蛋白多肽的理化功能特性尚有待進一步研究，為多肽產品的開發提供理論依據。