異養硝化－好氧反硝化菌的研究進展

要如磊

（陽泉煤業（集團）有限責任公司太原化工新材料有限公司,山西 太原 030400）

引 言

近年來,氮素污染所導致的水體富營養化已經引起了人們的廣泛關注,廢水脫氮研究尤為迫切。目前,生物脫氮工藝以其操作簡單、成本低、二次污染小、脫氮效率高等多方面的優點,在國內外污水處理中被廣泛應用。傳統生物脫氮包括好氧條件下的自養硝化過程和厭氧條件下的異養反硝化過程,分別由硝化菌和反硝化菌完成。硝化反應與反硝化反應對溶解氧濃度需求的不同導致好氧區和缺氧區的分開,二者在反應器上難以統一。

然而,隨著研究的深入,近年來人們發現有些脫氮微生物兼具異養硝化和好氧反硝化的功能,異養硝化－好氧反硝化菌成為生物脫氮領域內的一個新的熱點。這些新型脫氮微生物可以使硝化和反硝化反應能在同一反應器內同時完成,節省了反應空間,縮短了反應時間,平衡了反應條件,還克服了傳統生物脫氮存在的很多弊端。

1 異養硝化－好氧反硝化菌的類型

1983年,荷蘭Robertson和Kuenen最早從脫硫脫氮污水處理系統中分離出一株泛養硫球菌thiosphaera pantotropha（后更名為脫氮副球菌paracoccus denitrificans）,隨后發現它能同時進行異養硝化和好氧反硝化,其功能的特殊性吸引了國內外學者對異養硝化－好氧反硝化菌廣泛而深入的研究。

1989年,Robertson和Cornelisse對delft菌種保藏庫中某些異養硝化菌是否為好氧反硝化菌進行了研究。結果表明,具有異養硝化功能的脫氮假單胞桿菌pseudomonas denitrificans和糞產堿桿菌alcaligenes faecalis也具有好氧反硝化功能。

近十幾年來,國內外學者積極研究,新的異養硝化－好氧反硝化菌不斷被發現,大大拓寬了雙功能菌的種類。異養硝化－好氧反硝化菌主要存在于副球菌屬（paracoccus）、假單胞菌屬（pseudomonas）、產堿桿菌屬（alcaligenes）、芽孢桿菌屬（bacillus）、紅球菌屬（rhodococcuus）等（見第33頁表1）。

2 異養硝化－好氧反硝化菌的篩選方法

2.1 選擇性培養基法

利用不同氮源的選擇性培養基可以用來篩選異養硝化－好氧反硝化菌。首先,通過氨氮培養基初篩得到異養硝化菌,挑選氨氮去除能力較高的菌株；然后,將其接種于硝酸氮培養基進行復篩,最終得到異養硝化－好氧反硝化菌。Zhang［1］等先用硝化基礎培養基富集、分離、純化得到異養硝化菌,然后用反硝化培養基篩選出能利用NO－3、NO－2的菌株,從豬糞廢水中篩選得到YZN－001菌株。此菌株不僅能利用氨氮,而且能利用硝酸氮。

2.2 酸堿指示劑法

溴百里酚藍（BTB）指示劑的變色范圍為6.0～7.6,由黃色經綠色變為藍色。而反硝化作用消耗硝酸鹽或亞硝酸鹽后,OH－不斷積累,根據反硝化過程產堿這一特性在反硝化培養基中加入BTB,篩選平板上出現藍色暈圈的菌落,即可實現好氧反硝化菌的初步篩選。尹明銳［2］等利用BTB培養基分離得到好氧反硝化菌,進一步通過硝化測定,選取氨氮去除率在50%以上的菌株,確認得到3株異養硝化－好氧反硝化菌。

表1 新型異養硝化－好氧反硝化菌

而另一些研究者同樣利用溴百里酚藍指示劑的變色特點,先篩選得到異養硝化菌,進一步接種于含有1%BTB的反硝化培養基,能使培養基變藍,并且杜氏小管中有氣泡生成的菌株同時具有好氧反硝化作用。

2.3 滴加試劑法

格里斯試劑遇會變紅,二苯胺試劑遇會變藍,納氏試劑遇會變紅,該方法利用顯色反應篩選出目標菌。培養一段時間后,在硝化培養液中加入1滴～2滴格里斯試劑,如溶液立即呈粉紅色或棕色等,則表示氨氮轉化為亞硝酸氮,說明培養液中有硝化菌存在；進一步加入納氏試劑,培養液為無色,則表示氨氮轉化完全。同上方法,滴加格里斯試劑檢測反硝化培養液中是否有反硝化菌；進一步加入二苯胺試劑,若無色,則表示硝酸鹽轉化完全。蔣靜艷［3］等以乙酰胺為唯一碳氮源進行培養得到初篩菌,用格里斯試劑和二苯胺試劑驗證是否為硝化菌。袁夢冬［4］等將篩選得到的異養硝化菌接種至硝酸鹽還原培養基中,連續3d取樣滴加二苯胺試劑、格里斯試劑、納氏試劑,菌株的硝酸鹽還原實驗呈陽性,初步斷定該菌株同時具有異養硝化和好氧反硝化作用。

2.4 測試驗證法

另外,研究者還可以對已獲得的菌株進行硝化或反硝化能力測試,驗證其是否為異養硝化－好氧反硝化菌。Hung－Soo Joo［5］等對從污水中分離得到的異養硝化菌alcaligenes faecalis No.4進行探究,結果表明,被去除的氨氮中50%發生了反硝化,其既有硝化功能,也有反硝化功能。Joong Kyun Kim［6］等對24株芽孢桿菌經過異養硝化、好氧反硝化驗證,最終篩選出5株具有好氧反硝化功能的異養硝化菌。

選擇性培養基法篩選菌株準確,但涉及多次涂板、劃線,工作量大,篩選時間長；酸堿指示劑法篩選菌株準確,顏色變化明顯,操作方法簡單,分離快速高效；滴加試劑法篩選方法不準確,因為整個硝化、反硝化過程中、的積累量較少或沒有,加入格里斯試劑和二苯胺試劑呈陰性反應,并不能說明該菌株不具有硝化能力,容易漏篩目標菌；測試驗證法適合驗證某種已獲得菌株是否具有硝化、反硝化功能,并不適合異養硝化－好氧反硝化菌的直接篩選。

3 異養硝化－好氧反硝化菌的脫氮性能

目前,已經發現的異養硝化－好氧反硝化菌的脫氮性能較高。Taylor Shauna M［7］等從膜生物反應器中篩選得到一株雷氏普羅威登斯菌providencia rettgeri YL,在最優條件（C/N 10,30℃,120r/min）下,當氨氮質量濃度為84.63mg/L時,接種該菌48h后TN（總氮）去除率為79%。Zhao Bin［8］等對異養硝化－好氧反硝化菌bacillus sp.LY進行好氧脫氮性能研究。結果表明,在C/N 15、30℃最優條件下,當初始氨氮質量濃度為40mg/L時,最大氨氮去除效率可達到100%,TN去除效率可達78.9%。

大量研究表明,異養硝化－好氧反硝化菌在轉化氨氮為氣態氮化物的同時,還利用氮源發生同化作用,轉化為菌株細胞內的含氮有機化合物。Hung－Soo Joo 等 研 究 高 濃 度 氨 氮 下 alcaligenes faecalis No.4的脫氮效率,當初始質量濃度高達1 200mg/L時,接種菌株93h后,幾乎所有氨氮被去除。其中,50%轉化為細胞內含氮物質,3%轉化為硝化產物,40%～50%發生反硝化作用。GC－MS證明90%的反硝化產物為氮氣。Chen Qian［8］等對農桿菌agrobacterium sp.LAD9在異養硝化－好氧反硝化過程中的氮平衡進行研究,TN初始質量濃度為97.19mg/L。接種該菌24h后,50.1%的 TN被轉化為氣態氮化物,40.8%的TN轉化為生物量。由此可見,異養硝化－好氧反硝化菌的生物同化作用成為限制總氮去除率的一個主要原因。

4 總結與展望

綜上所述,異養硝化－好氧反硝化菌的屬種范圍逐步擴大,篩選方法日益成熟,脫氮效率可達到50%～80%。新型異養硝化－好氧反硝化菌能利用多種無機氮源,減少反應器數量,減小外加堿量,降低成本,在污水處理方面應用前景廣泛。但是,異養硝化－好氧反硝化菌的總氮去除效率仍然較低,將菌株固定化、提高微生物濃度、實現菌種的固液分離和回收,對提高脫氮效率有非常重要的意義。

參考文獻：

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［3］ 蔣靜艷,胡正華,黃耀.異養硝化－好氧反硝化菌的分離鑒定及其在不同培養條件下產N2O研究［J］.環境科學,2009,30（7）：2105－2111.

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