二甲雙胍通過AMPK通道對界膜中滑膜成纖維細胞的增殖和成骨作用的研究

陳坤 李奇

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院（廣州 510280）

無菌性松動（aseptic loosening，AL））是關(guān)節(jié)假體移植發(fā)生松動的主要原因之一，在假體與骨界面應(yīng)力過大就會產(chǎn)生一定的微動［1］，達到一定的微動程度就會抑制假體周圍骨的長入，從而形成一定的空隙而填充界膜。界膜主要含有巨噬細胞、成纖維細胞（synovial fibroblasts，F(xiàn)LSs）、異物巨細胞、破骨細胞和淋巴等細胞，其中成纖維細胞占到30%～70%［2］。FLSs與間質(zhì)干細胞具有同源性，具有成骨分化的潛力，有研究發(fā)現(xiàn)牙周成纖維細胞在周期應(yīng)力的刺激下有分化成骨的能力［3］。目前二甲雙胍對成骨和破骨作用研究集中在對巨噬細胞、破骨細胞、成骨細胞和間充質(zhì)干細胞方面，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍激活A(yù)MPK信號通道在多個組織、器官中對巨噬細胞有著明顯的抑制炎癥作用，如可明顯抑制巨噬細胞在脂多糖（LPS）和磨損顆粒誘導(dǎo)下的L?6、iNOS和OPG等溶骨炎癥因子的表達［4-5］。同時二甲雙胍和AICAR也促進成骨細胞細胞外成骨，同時AMPK通道阻滯劑compound C能抑制成骨細胞細胞外成骨［6］。可見AMPK通道對多種細胞都有著促骨生成的效能。同時磨損顆粒可以誘導(dǎo)FLSs分泌RANKL/OPG比例的增高，促進溶骨［7］。二甲雙胍在對細胞增殖抑制方面，其對多種腫瘤細胞生長具有抑制作用，并促進其凋亡或抑制腫瘤細胞的周期，例如對前列腺癌細胞、肺癌細胞、肝癌Hep G2細胞和直腸癌細胞等，通過LKB1?AMPK?mTOR通路直接抑制腫瘤的生長和降低宿主胰島素水平間接作用于惡性腫瘤細胞［8-11］，進一步發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對成纖維細胞也表現(xiàn)生長抑制的作用［12］。假體與骨間隙中的FLSs大量增殖形成界膜，界膜為巨噬細胞、破骨細胞提供良好的微環(huán)境，同時FLSs本身增殖和在顆粒誘導(dǎo)下RANKL/OPG比例失調(diào)都是促進假體松動的重要原因。所以本研究致力于二甲雙胍對FLSs增殖和成骨方面，驗證二甲雙胍抑制FLSs的增殖同時促進FLSs成骨的作用，體外實驗檢測成骨活性特異性標(biāo)準(zhǔn)酶?ALP和細胞外鈣結(jié)節(jié)。二甲雙胍抑制界膜的增殖，促進骨形成，有利于骨和假體的融合而穩(wěn)定假體，為臨床假體AL預(yù)防和治療提供新的思路，同時有利于老藥新用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑標(biāo)本取自南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院關(guān)節(jié)外科年輕膝關(guān)節(jié)損傷患者關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中切除的滑膜，已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。胎牛血清（Gibico）、DMEN/F12培養(yǎng)基，I型膠原酶（sigma），兔抗人OPG抗體（abcam），兔抗人RANKL抗體（abcam），鼠抗人HIF?1α（cst），羊抗兔二抗（博奧森），羊抗鼠二抗（博奧森），兔抗人vimentin（H?84）（Santa CruzBiotechnology），兔 抗 人 CK18（Santa Cruz Biotechnology），羊抗兔二抗（中衫金橋）。兔SP試劑盒（中衫金橋），BCIP/NBT Kit（康為），茜素紅S染色液（索萊寶），鹽酸二甲雙胍（MedChem Express），AICAR（Inhibitor Expert），Compound C（MedChem Express），抗壞血酸（索萊寶），β?甘油磷酸（索萊寶），地塞米松（索萊寶）。超靈敏化學(xué)發(fā)光儀（Biorad），酶標(biāo)儀（Bio?tek）。

1.2 實驗方法

1.2.1 FLSs的提取與鑒定將組織置于六孔板內(nèi)，用PBS漂洗三遍。移入潔凈的孔內(nèi)，滴入一滴全培液（含10%血清、1%青霉素鏈霉素雙抗的DNMEM/F12培養(yǎng)基），眼科鑷將組織剪碎至1 mm×1 mm大小，加入2%Ⅰ型膠原酶3 mL，移入37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化4 h，每30 min輕輕震蕩樣本。四小時后將消化后的混合液體用直徑70 μm細胞濾網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心濾液5 min，傾棄上清全。加入適量的全培液，移入25 cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，24 h后顯微鏡小觀察貼壁的細胞，并更換新的完全培養(yǎng)基。此后每3天更換新的培養(yǎng)基。待細胞覆蓋瓶底80%瓶底時，進行傳代，取培養(yǎng)4或5代純化的細胞用于實驗。通過形態(tài)觀察、角質(zhì)蛋白和波形絲細胞免疫化學(xué)染色對FLSs進行鑒定。

1.2.2 二甲雙胍對FLSs生長的影響取第4代的細胞行MTT檢測，以5×103/孔接于96孔板，實驗分組設(shè)置：① 5個藥物濃度組：0、5、20、40、60 μmol/L和②3 μmol/L AICAR、20 μmol/L二甲雙胍，然后采取MTT檢測①②組在不同時間段對FLSs抑制的OD值，然后計算出抑制率；

1.2.3 二甲雙胍對FLSs的成骨誘導(dǎo)分化取第4代的細胞行成骨誘導(dǎo)分化，以5×104/皿接種于6 cm的培養(yǎng)皿中。實驗設(shè)置：A、B和C組：A：空白，B：20 μmol/L 二甲雙胍，C：50 mg/L 抗壞血酸+0.1 μmmol/L地塞米松+0.5 mmol/Lβ?甘油磷酸鈉。再采用堿性磷酸酶染色檢測和茜素紅染色，分別檢查二甲雙胍促進FLSs合成堿性磷酸酶和生成鈣結(jié)節(jié)的效能。其中堿性磷酸酶染色分別檢測3組（A、B和C組）培養(yǎng)7、14和21 d后堿性磷酸酶活性的結(jié)果；茜素紅染色分別檢測3組（A、B和C組）培養(yǎng)21、28和35 d后細胞外鈣結(jié)節(jié)形成的結(jié)果。

1.2.4 檢查二甲雙胍對FLSs信號通道AMPK的表達及磷酸化的影響取第5代的細胞行West?ern Blot檢測，以5×105/皿接種于10 cm的培養(yǎng)皿中。實驗設(shè)置①0、5、20、40 μmol/L 組和② 3 μMAICAR、20 μmol/L 二甲雙胍組，使用 Western Blot檢測不同藥物處理3 d時的FLSs的AMPK信號通道表達及磷酸化水平的情況。

1.3 觀測指標(biāo)倒置顯微鏡下觀察FLSs培養(yǎng)第4代時的形態(tài)以及細胞免疫化學(xué)染色對FLSs的成纖維屬性鑒定結(jié)果。MTT檢測出不同組的OD值并計算出抑制率。倒置顯微鏡下觀察堿性磷酸酶染色和茜素紅染色結(jié)果。Western Blot檢測不同二甲雙胍和AMPK通道的激動劑作用下通道AMPK表達及磷酸化水平情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法所得數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，組間差異使用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色和細胞免疫化學(xué)鑒定結(jié)果低倍鏡下可見細胞為長梭形，胞體比較大，也可見少量的多角細胞，胞核較大，核呈卵圓形和圓形，1～2個核仁（圖1A）。角質(zhì)蛋白細胞免疫化學(xué)染色呈陰性（圖1B）。波絲蛋白細胞免疫化學(xué)染色呈深棕色，呈強陽性（圖1C）。

圖1 細胞形態(tài)和細胞免疫化學(xué)染色Fig.1 Cell morphology and immunocytochemicalstaining

2.2 MTT檢測結(jié)果二甲雙胍在一定濃度范圍內(nèi)濃度越高對FLSs的增殖抑制越明顯，有明顯的濃度依賴性，但在時間梯度方面，隨著作用時間的加長二甲雙胍對FLSs的抑制沒有明顯的增強，當(dāng)二甲雙胍為60 μmol/L時，隨著作用時間抑制趨勢有著明顯增強的趨勢（圖2A）。濃度為3 μmol/L的AICAR作用FLSs也表現(xiàn)出來了明顯的增殖抑制趨勢作用（圖2B）。

圖2 MTT結(jié)果Fig.2 MTT Results

2.3 堿性磷酸酶和茜素紅染色結(jié)果用20 μmol/L的二甲雙胍和50 mg/L抗壞血酸+0.1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/Lβ?甘油磷酸鈉作用于FLSs 7、14和21 d，可見在7 d時，二甲雙胍組和50 mg/L抗壞血酸+0.1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/Lβ?甘油磷酸鈉組表現(xiàn)出明顯誘導(dǎo)FLSs合成堿性磷酸酶的趨勢，相對對照組陽性趨勢明顯。同時表現(xiàn)明顯的時間依賴性，作用時間越長誘導(dǎo)合成堿性磷酸酶越明顯（圖3）。20 μmol/L的二甲雙胍和50 mg/L抗壞血酸+0.1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/Lβ?甘油磷酸鈉同時表現(xiàn)出明顯誘導(dǎo)FLSs細胞外鈣結(jié)節(jié)形成的趨勢，同時有著明顯的時間依賴性（圖4）。

2.4 Western Blot檢測結(jié)果不同濃度二甲雙胍作用FLSs 3 d，可見信號通路AMPK在FLSs總體表達量恒定，二甲雙胍能促進AMPK磷酸化，同時有著明顯的濃度依賴性（圖5A）。3 μmol/L AICAR也能明顯的促進AMPK的磷酸化（圖5B）。

3 討論

圖3 堿性磷酸酶染色Fig.3 Alkaline phosphatase（ALP）staining

假體的磨損顆粒誘導(dǎo)一系列的溶骨炎癥是引起無菌性松動主要原因，隨著國內(nèi)關(guān)節(jié)假體置換患者基數(shù)增大，對無菌性松動的預(yù)防和治療迫在眉睫。二甲雙胍是治療Ⅱ型糖尿病治療的一線藥，近期大量研表明二甲雙胍有著促進骨生成和抑制多種腫瘤細胞的增殖的效能。二甲雙胍通過AMPK通道可促進成骨細胞的骨保護素分泌且抑制RANKL分泌，抑制破骨細胞的分化和活性，抑制UHMWPE誘導(dǎo)巨噬細胞多種溶骨炎癥因子的釋放。同時二甲雙胍對多種腫瘤細胞及成纖維細胞生長具有抑制作用，并促進其凋亡或抑制腫瘤細胞的周期。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可抑制FLSs增殖生長，其抑制效應(yīng)有著濃度依賴性，隨著濃度越大抑制率越大，并在濃度約為60 μmol/L抑制率達到50%。在AICAR作用于AMPK也可抑制FLSs的增殖，同時具有時間依賴性。二甲雙胍對FLSs的促骨效能方面，在二甲雙胍的作用下，能促進FLSs成骨活性特異性標(biāo)志酶?ALP的合成和細胞外鈣結(jié)節(jié)的沉淀。在培養(yǎng)7 d時可見ALP活性明顯增強以及有著明顯的時間梯度。在21 d時可見明顯的細胞外鈣結(jié)節(jié)的沉淀，也有著明顯的時間梯度性。陽性對照組（抗壞血酸、β?甘油磷酸和地塞米松合劑）FLSs培養(yǎng)7 d時也可見堿性磷酸酶合成明顯增加和21 d時細胞外出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，同時有著時間依賴性。二甲雙胍作用AMPK信號通道，促進AMPK通道的磷酸化。二甲雙胍作用于AMPK通道，促進其磷酸化，同時抑制下游重要靶點m?TOR的磷酸化，從而發(fā)揮抑制FLSs增殖和促進FLSs成骨的生理功能。但有研究表明二甲雙胍通過IGF?1/PI3K/AKT/m?TOR發(fā)揮著間接作用，大量研究表明二甲雙胍通過該通道可抑制多種腫瘤細胞的增殖，并阻滯其周期在G2期等期限［13］，再者二甲雙胍還能通過該通道抑制強直性脊柱炎關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞的炎癥反應(yīng)［14］。但對二甲雙胍是否也通過IGF?1/PI3K/AKT抑制m?TOR的磷酸化發(fā)揮間接作用而抑制FLSs增殖和促進成骨的研究目前國內(nèi)外尚未報道。本研究也未對二甲雙胍作用AMPK通路后的下游通路展開詳細研究。筆者后期要對二甲雙胍通過IGF?1/PI3K/AKT/m?TOR發(fā)揮著間接作用和二甲雙胍作用AMPK通路后的下游通路機制展開詳細研究。國內(nèi)外目前集中在巨噬細胞、破骨細胞和骨髓間充質(zhì)細胞方面的研究，在二甲雙胍對FLSs成骨和增殖方面尚未研究報道。本研究為臨床假體無菌性松預(yù)防和治療提供新的思路和靶點，同時有利于老藥新用。

圖4 茜素紅染色Fig.4 Alizarin Red S staining

圖5 Western BlottingFig.5 Western Blotting

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